人Leptin的高效表达、纯化与生物学活性研究.pdfVIP

入Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究 山东省肿瘤生物治疗中心山东省医学院基础所(250062) 刘金生赵跃然王郡甫游力张捷田志刚 摘要将人Leptin表达质粒pBV200--OB转化宿主菌E．coli JMl09，热诱导 获得目的蛋白的表达。经SDS鉴定分析，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的 S200HR凝胶和 40％以上，且以包涵体的形式表达。通过包涵体分离，Sephacryl 化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合；蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和 预期的序列一致。纯化产物经复性处理，其分子中Cys96和Cysl46形成二硫键。 增长，提示其具有明显的生物学活性。 关键词Leptin，基因表达，大肠杆菌，蛋白纯化 Leptin是近年来发现的由肥胖基因(obese gene，OB)编码、脂肪细胞合成分 泌肽类激素，其作用于下丘脑的特异受体(OB 肽的分泌；或直接作用于相应外周靶细胞的OB—R，包括作用于早期造血干细胞， 促进其分化成熟，作用于免疫系统，调节机体的免疫应答等，具有广泛的生物学效 应。初步动物实验和临床研究表明，Leptin可用于肥胖症和Ⅱ型糖尿病的治疗。为 探讨重组人Leptin用于上述疾病临床治疗的可行性及其生理作用，我们构建了其高 效表达菌株，建立了重组Leptin的分离纯化技术并进行了初步生物学研究，现将结 果报道如下。 1．材料和方法 J．J．生化和化学试剂 蛋白陈和酵母提取物为Oxide产品；Sephacryl C Cruz 18为购自pharmacia；兔抗人Leptin抗体购自Santa 它为进口或国产分析纯试剂。 ．68． pBV220-OB由本室构建，并转化大肠杆菌JM 109，获得高效稳定表达菌株 1．3．动物18+lg的雌性BALB／c小鼠购自山东医科大学实验动物中心。 1．4．重组菌株的诱导 、 J．5．包涵体的制备 6M尿素，50mMTris-HCl，PH8．0溶解。离心，保留上潦 1．6．重组蛋白的纯化 sephacryls200HR层析柱，用同一缓冲液进行洗脱，流速2 ml／mim洗脱液加入 mm 用20mMTris-HCl，pH8．5，1 换分离的Leptin组份用反相色谱进行纯化。分离柱为Hy岬flC18，梯度洗脱条件 定。纯化的kptin冻干，备用。 1．7．重组蛋白的复性 pH8．0， 2．5mmol／L阳缸基乙醇和2．5mmol／L Tris-HCl 30min。用6mol／L脲，20mmol／L Tris-HCl 液进行1：10稀释．而后行透析：1倍体积的20mmol／LpH7．4和 Tris-HCl Tris-HCl DTT透析5_8h；最后用20mmol／Lpn7．4和 pH7．4和5mmol／L 100retool／L Nacl透析18-24h，浓缩并用O．22#m滤器过滤除菌备用。 1．8．SDS釉Western