中华绒螯蟹表达序列标签(EST)分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究.docVIP

中华绒螯蟹表达序列标签（EST）分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究 【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国的重要增养殖对象之一。近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高,由细菌、病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日趋严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。至今,病害仍然是困扰其养殖业的一个重要因素。除改善环境因素外,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的一个重要方法。本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制,以其为这一重要方法提供坚实的理论基础。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,不仅丰富了中华绒螯蟹的基因数据,同时筛选出许多与免疫相关的基因序列。在此基础上,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和实时定量PCR技术进一步对主要的免疫相关基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华绒螯蟹免疫机制提供了基础资料,同时也为蟹病的防治提供了新思路。主要研究结果如下:1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了滴度为4.50×10~6CFU/mL,库容为3.3×10~6CFU/mL,重组率为73%的中华绒螯蟹血细胞cDNA文库;从文库中随机挑取了3,118个克隆进行5’-端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到3,041条高质量EST序列,这些序列的平均长度为561bp。经拼接后获得了1,049条unique序列,包括292条重叠群(Contig)和757条单一序列(Singleton)。通过比对发现有488条Unique序列被注释成已知的功能基因,551条Unique序列未被注释任何功能;通过GeneOntology功能分类发现了26个中华绒螯蟹先天性免疫反应,如参与酚氧化酶系统的丝氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,参与凝集反应的谷胱酰胺转移酶,与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶,抗菌肽类的抗脂多糖因子、甲壳素、以及Osmotin,模式识别分子类的C-型凝集素、甘露糖结合蛋白、脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白、Toll受体蛋白。通过EST表达丰度分析发现,中华绒螯蟹血细胞主要免疫相关基因为Kazal-型蛋白酶抑制剂和C-型凝集素。2模式识别蛋白及其功能的研究是当前甲壳动物免疫学的研究重点之一,许多物种的模式识别蛋白及其功能已经明确。本研究根据EST提供的信息,采用RACE技术成功克隆了中华绒螯蟹一种模式识别蛋白-脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因全长cDNA序列。生物信息学分析发现,该序列全长为1,236bp,包括26bp的5’-末端非转录区(5’-UTR),1,089bp的开放阅读框(ORF)和121bp的3’-末端非转录区(3’-UTR),共编码362个氨基酸,包含一个由15个氨基酸组成的信号肽;蛋白序列与中国明对虾(Penaeuschinensis)、细角滨对虾(Litopenaeusstylirostris),凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)和淡水螯虾(Pacifaxtacusleniusculus)LGBP的相似性分别为67%、66%、66%、61%;该基因编码蛋白含有几个保守的区域,如整合素结合区,激酶C磷酸化位点,N—连接的糖基化位点等,另外还发现了一个水解酶位点。实时定量PCR结果显示,LGBP基因mRNA在中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、肌肉、血细胞、胃和肠中均有表达,其中在血细胞中的表达量最高。用嗜水气单胞菌进行急性感染实验发现,LGBP在血细胞中的表达量在感染后1.5h达到最高水平,与对照组相比存在显著性差异(P＜0.05),而后表现为下降趋势,在感染后12h恢复到起始水平,说明该基因参与了中华绒螯蟹的抗病过程。3酚氧化酶原激活酶(PPAF)的活化以及PPAF活化酚氧化物酶原是酚氧化物酶系统行使非特异性免疫功能的关键步骤。本研究成功克隆了中华绒螯蟹PPAF基因全长cDNA序列。该序列全长为1,386bp,其中包括154bp5’-UTR,1,134bpORF和95bp3’-UTR,编码378个氨基酸。该编码蛋白含有信号区域、半胱氨酸折叠区域和保守的丝氨酸区域。该。PPAF氨基酸序列与其它无脊椎动物PPAF氨基酸序列相比,具有很高的相似性(55%-75%)。PCR结果分析表明肝胰腺、肌肉、肠道、鳃中均有PPAF的表达。嗜水气单胞菌急性感染后6h、12h、48h,与对照组相比PPAF基因mRNA表达水平均显著增加(P＜0.05)。结果表明PPAF与机体对外来病源的防御作用密切相关。4作为抗氧化酶类,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(G