尺寸排阻色谱对还原变性牛胰岛素折叠特性地研究.pdfVIP

—— 坌堑些兰堕生塾皇些些 ～—— 尺寸排阻色谱对还原变性牛胰岛素折叠特性的研究 自泉 孔宇董翠花耿信笃 (西北大学现代分离科学研究所现代分离科学陕西省重点实验室西安710069) 关键词蛋白折叠尺寸排阻色谱蛋白变陆尺寸排阻色谱二硫键 在生物工程中，用重组DNA技术在大肠杆菌(ECoh)中表达的许多蛋白药物，由于疏水 性很强，形成了难溶于水的包含体，只有加入变性荆，才能溶解。而对于那些含有二硫键的蛋白 药物．还需向包含体提取液中加入还原剂．如卢巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等，先将错误配 对的二硫键打开．再进行折卺或复性帆所以，如何提高变性蛋白在折叠过程中二硫键的正确对 接率，对蛋白药物的纯度和产率的提高及生物工程技术的发展具有非常重要的意义．这亦是分子 生物学中的前沿课题。对于还原变性蛋白的复性，通常在复性溶液中加入氧化剂．如氧化型谷胱 甘肽(GSsG)，使二硫键在氧化条件下正确对接眈还有人加入二硫键异构酶Ⅲ和分子伴侣pl催化 二硫键的正确配对．从而提高蛋自的复性效率。但这些方法条件苛刻，不易控制，又易引入杂蛋 exclusion 尺寸排阻色谱(Size 复性，取得较好的效果。本文拟以标准牛胰岛素为模型蛋白，用尺寸排阻色谱研究还原变性牛胰 岛素的折叠规律。 1还原变性的胰岛素在SEc上的分离 SEC是根据蛋白质分子的大小对其进行分离的。对于不同分子构像的同一种蛋白质，用SEC m01几Tns+1mlTiOl，L 分离可得到不同的色谱峰。采用流动相1(O．1 EDTA，pH=8．2)，将还 原变性的胍变和脲变irIsulin分别用SEC进行分离，结果表明，二者色谱峰的保留时间均较天然胰 岛素长，且峰型变宽．峰高变低(色谱图未示)，说明采用该流动相l无法将还原变性的胰岛素 折叠成天然构像。 2氧化型流动相对还原变性胰岛素复性的影响 molFLTris+0．2mol／LNaCl 按一定比例将GsSG和GsH加入到流动相中．如流动相2(0．1 +l urea mmol／L +0．2moLLNaCl+1mmol／LEDTA+O．3GSSG+3mm01，L GSH，pH=8_2)组成所示， 研究氧化型流动相对还原变性胰岛素复性的影响。采用流动相2，I}}jSEC对还原变’}生的胰岛素进 行分离，结果表明，胍变和脲变胰岛素色谱峰的保留时间亦均比天然的长，说明虽然在流动相2 中加入了氧化剂，但仍不能使还原变性的胰岛索复性。图1是采用流动相3，还原变性胰岛素在SEc 上的色谱分离圈，从图中可看出，还原的胍变和脲变胰岛素(目1斫nlc)色谱峰的保留时间与天 然胰岛素(图Ib)相同，表明采_L}：|流动相3可使还原变性的胰岛素复性。比较流动相2和3，_二者 mol，L脲。在2．0 差别在于3中还加入了2．0 moI／L脲存在下，可防止胰岛素的聚集．而GssG作为 的配对15]。因此，GSSG参与了变性蛋白质的折叠过程，并提高了二硫键正确对接率和胰岛素的 复性效率。 图1 氧化型流动相对还原变性的胍变、腮变及天然胰岛素在sEc中折叠的影响 a腮变tb天然，0胍变，流动相为3，胰岛素进样量为500 Bg 参考文献 R M，Freedman Ruoppolo Biodleafistry,1995。34：93舯