组织与细胞培养.docVIP

一、名词解释： 细胞杂交：在体外条件下，通过人工培养和诱导将不同种生物或同种生物不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。两个或多个不同的细胞融合导致形成合核体。 细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株，也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。 克隆：细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞并使其在体外繁殖成新的细胞群体。P249（这种纯化的细胞群体称为细胞株，它们当中的每一个细胞的遗传特征及生物学特性极为相似，有利于对不同亚群细胞的形态和功能进行比较和研究。） 骨间中质干细胞（骨髓基质干细胞）：在哺乳动物的骨髓基质中，存在具有形成骨、软骨、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，称之为骨髓基质干细胞。 原代培养：也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的细胞具有很多特点，首先组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合做药物测试、细胞分化等实验研究。 有限细胞系：又称生长细胞系，这种细胞系的寿命一般只能维持一定的时间期限，不能够连续培养。因此，在体外培养的细胞，其生命的期限并非无限的。 无限细胞系：又称连续细胞系，指能够连续传代的细胞系。 细胞传代：原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖，单层培养细胞相互汇合整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。 一·人脐静脉细胞的原代培养及鉴定 在超净台上，将脐带浸泡在PBS中清洗干净脐带表面的血液。修剪平整脐带两端，将12号针头从一横截面插入脐静脉，注入PBS（37℃预先温育）冲洗3遍以上，直至流出液清亮无色，最后注入空气挤走脐带中的PBS。用止血钳夹住两端，吸取10ml预热的0．1％Ⅱ型胶原酶溶液，经针头缓缓注入脐静脉，使之充盈，再将脐带浸于装有PBS（37℃预先温育）的灭菌烧杯中，用灭菌的蜡纸盖上置于37℃水箱中消化30～45min。其间用镊子揉捏脐带2～3次，使内皮细胞与酶液的充分接触并促进内皮细胞脱落。消化完毕后，剪去脐带无针头端止血钳夹闭处，抬起另一端使酶液流入含血清培养基的烧杯中，终止消化。再用PBS溶液快速冲洗脐带2次。收集的液体1000r／min离心10min。吸弃上清和絮状物，加入3ml原代细胞生长液吹散细胞，转移到60mm培养皿中，置于37℃、含5％CO2的培养箱培养 鉴定：倒置显微镜下观察细胞的形态并摄片；培养皿中加入700μlTripleexpress消化液，放入培养箱中3min，收集消化液，1400r／min离心4min，弃上清，PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入10μl直标抗人CD34单克隆抗体，闭光室温孵育30min，上机读数。 经CD34流式细胞仪鉴定，与空白组相比，加入抗体的内皮细胞呈红色荧光。 第VIII因子抗原检查：因第VIII因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，故它可作为内皮细胞的鉴定标准。第VIII因了抗原检查包括：1.免疫荧光法。免疫荧光法可见内皮细胞的细胞质呈黄绿色荧光，核周尤其明显，包核清楚，细胞轮廓清晰。2.免疫组化法。免疫组化法结果可观察到内皮细胞的细胞质内呈棕黄色沉淀，以核周最为明显，胞核不着色，细胞界限清楚。 CD144为内皮细胞特异性标志，常用检测方法有免疫细胞化学法、反转录聚合酶链反应检测及Western blot检测法。CD144免疫细胞化学阳性细胞染色表现为胞膜着棕黄色颗粒；反转录－聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞目的基因CD144有较强表达；Western blot检测传代的人脐表脉内皮细胞，显示高表达CD144，表明内皮细胞的特性保存完好。 CD34免疫组织化学染色：CD34是一种细胞分化抗原和选择素的配体，自从发现血管内皮细胞有CD34的基因表达后，常被用来标记血管内皮细胞。由于CD34阳性表达强于第VIII因子，因此，它被认为是目前血管内皮细胞最可靠的标记。CD34免疫组织化学染色显示，原代及传代细胞的细胞质内均有阳性染色，细胞轮廓清楚，阴性对照无此反应，证实所培养的细胞为脐静脉内皮细胞。 倒置相差显微镜观察：人脐静脉内皮细胞在4h时可见部分细胞贴壁，伸出伪足。24h时，细胞完全贴壁，并呈单层排列，边界清楚，为圆形、短