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一个新的SINPV凋亡抑制基因的克隆及 细胞凋亡抑制机制的研究 裴子飞杜全胜 齐义鹛“ 刘映乐 肖化忠 武汉．武汉大学病毒研究所，430072 摘要：病毒感染可诱发宿主细胞的凋亡。有些病毒在侵入细胞后表达抑 制细胞凋亡的蛋白，并通过抑制细胞的凋亡而实现其感染及增殖。某些杆状 病毒可编码分子量为35KD的蛋白，它是病毒的早期基因p35的产物，体内 与体外试验表明，此35KD蛋白可抑制多种细胞的凋亡。海灰翅夜蛾是流行 于地中海地区的主要以危害棉花等农作物的害虫，海灰翅夜蛾核型多角体病 制基因，我们构建了一套代表整个SINPV基因组的重组粘粒克隆文库．并将 DNA片段，经进 分离了一个能拯救vAcaP35pol在昆虫细胞中感染的SINPV 一步亚克隆及拯救试验，得到了一个新的SINPV凋亡抑制基因p49。用杆状 病毒表达系统表达的P49蛋白的氨基酸序列与推导的氨基酸序列一致，证明 p49基因编码序列经克隆后能够正确表达。体内标记显示：SINPV感染昆虫 细胞后，在感染早期及晚期．p49基因均可表达；在由多角体基因启动子驱 动p49基因的重组病毒中，p49基因的表达只是在晚期，但表达量明显高于 的凋亡抑制基因(p35)一样，也是一个早期基因，但在晚期也可表达，与 9 多角体基因启动子比较p49基因的启动子是一个较弱的启动子。纯化的P4 14 割，证明P4 9蛋白的凋亡抑制机制与Caspase有关。经比较与分析P49蛋白 的氨基酸序列后，推测其9l至94位的氨基酸序列为典型的Caspase识别与 切割序列，采用定点诱变的方法使94位的天冬氨酸变成丙氨酸(D94A)，得 到突变的P49蛋白，发现此蛋白不被Caspase所切割。同时也失去了抑制凋 亡的功能。在细胞凋亡信号传导通路中P49蛋白是一个新的凋亡抑制因子。 关键词：细胞凋亡，p49基因，Caspase，体内标记 gfp基因标记的重组杆状病毒对昆虫幼虫的 侵染历程+ 吕颂雅，扬复华，齐叉鹏，刘祖强 0072 武汉大学病毒研究所，武昌，43 本文以腔肠动物水母(Aequorea flurenscent (Heliothis nuclear virus，HaNPV)，用此带荧 armigera polyhedrosis 光标记基因的棉铃虫病毒(rHa—GFP)感染棉铃虫三龄幼虫，令gfp基因在 杆状病毒极晚期多角体基因启动子驱动下表达，产生绿色荧光蛋白。在感染 后的不同时间采集棉铃虫的不同组织标本：血细胞、中肠细胞、脂肪体细胞 和真皮细胞，制片后，在倒置荧光显微镜下观察荧光出现情况。结果发现， 随着感染时间的推移，荧光产生的部位出现更替，随后荧光强度也发生相应 变化，在感染后4小时和8小时，血细胞和中肠细胞中均不出现荧光，但在 l2小时后，血淋巴和中肠中都有少量细胞出现荧光，24小时后则更多细胞 出现荧光，36小时后多数细胞出现荧光，60小时后发荧光的细胞数减少。 感染48小时后，分布于中肠上皮组织的气管部分出现荧光，60小时后，中 肠上皮组织的气管太多出现荧光。感染24小时后，脂肪体中可见一些荧光