中性β-甘露聚糖酶产生菌的分离筛选和其产酶条件研究.pdfVIP

中性R-甘露聚糖酶产生菌的分离筛选及 其产酶条件研究 陈一平 龙健儿 廖连华 (中国科学院成都生物研究所，成都610041) 摘要 从土堆中分离列9株产生p一甘东采掩璐的芽抱杆蔺 (Bacillussp.)oBacillwp.M50250.,1三角 瓶摇瓶培养试脸，以4%的魔芋粉为破源，1。% (NH,),S0,为致海，0.35%N%CO30--343;培养 60h产吟达到高峰。醉活力为180-200u/mLo100,1雄发肆，以2%魔芋粉为破派，在30-329:,1: v/v/057.. 通气-,200dmin条件下，发嘴液璐活力最高可达330.44./.L.璐的最适反应滋度和pH分 别为50℃和6.0，低于50T,pH5.0一7.0膝德定。Fe,AI,EDTA,Hg’对璐有抑制作用，而 Be,‘M.’对阵有激活作用。 A一甘露聚糖酶 印一1,4-D-mannanmannohydrolase,EC3.2.1.78)是一种降解甘露聚糖、 葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链p一1,4-D一甘露毗喃搪昔键的酶。 自50年代以来，微生物产生的p一甘露聚糖酶陆续被发现和报道。近年来，随着对自然界第二 大植物多糖资源一半纤维素的开发以及具有上述结构的植物多糖的酶解产物药用价值和保健功 能的发现，为该醉在食品、医药、饲料、造纸、纺织等领域的应用开辟了广阔的前景。 功能性低聚搪是当今世界保健品的主流产品。我国目前功能性低聚糖品种不多，以高科技 为背景的新功能性低聚糖的开发应用已成为生物技术领域研究的新热点，而新型功能性低聚搪 的开发有赖于酶学性质优良的产酶菌株的分离和筛选。中性p一甘露聚糖醉产生菌的分离、筛选 和酶学性质的研究，可以有效地开发我国丰富的魔芋资源。 1材料和方法 1.1 菌株 供试菌株Bacillussp.M，系从四川大竹、安县等地采集的土样中分离得到。 1.2 培养基和培养方法 1.2.1富集培养基:魔芋粉20g,凡HPO,3H,O0.5g，土壤浸提液100ML,pH7.2，加水至1L. 1.2.2分离培养基:魔芋粉5g，蛋白膝log，酵母青2g,MgCl,6H,00.2g,K,HPO,3H,Olg,琼 脂粉15g,pH7.2，加水至IL. 1.2.3发酵培养基:魔芋粉20g,醉母膏4.0g,(N氏),SO46.0g,Na,HI狱12从04.0g,KH,PO, 2.0g,CaC1,3.Og,MgCl,6H,00.6g,Na,C几3.5g,CoCI,-6氏00.01g,MnCl,4姚01.0g,(矿物 盐类和磷酸盐分开灭菌)pH7.0一7.2，加水至1L. 2.4 培养方法:250mL三角瓶装30mL发醉培养基，200r/min,30℃恒温旋转振荡培养60h. 醉活力测定 R一甘露聚糖酶活力测定:吸取0AmL1.0% (w/v)角豆胶溶液 (以pH6.0,0.05mol/L Na,HP04.12Hi0一m0025.1 几柠棣酸缓冲液配制)，加人0.1mL经适当稀释的粗酶液，50℃水浴 反应5min后，DNS法测定酶解液的还原糖基含量。酶活力单位定义:在上述反应条件下，每分 钟释放lpmol相当于D一甘露糖的还原搪基所需的酶量为一个酶活力单位 (a). 1.4 菌体浓度浏定 发酵液以0.8%NaCl溶液适当稀释后，721分光光度计测660nm处的吸收值。 98 1.5 菌种鉴定 根据 一《般细菌常用鉴定方法》和Berger，细菌鉴定手册第八版对供试菌株属的特征进行 鉴定。 2 结果 2.1 产酶菌株的初筛 将采集的土样，分别用富集培养基30℃振荡富集培养7a，富集液经80℃热处理10min,稀 释法分离，在形成单菌落的平皿中，以WilliamsAG.报道的多糖染料和多糖底物反应生成透明 圈检测半纤维素降解菌的方法，用游标卡尺分别测量菌落直径 (C)和透明圈直径 (H)，经初筛 得到H/CI共68株菌。 2.2 产酶菌株的复师 采用发酵产酶培养基，用上述发酵产酶培养方法进行复筛。经初筛得到的68株菌进行发醉 产酶试验，测定酶活力，得到9株胞外p一甘露聚搪酶产生菌。其中菌株Mm具有产酶时间短， 产酶稳定等特性，将其作为试验研究菌株。结果如表2. 衰Z