中华绒螫蟹多倍体人工诱导研究.pdfVIP

中华绒螯蟹多倍体的人工诱导研究’ 陈立侨堵南山 赖伟 (华东师范大学生物学系．上海200062) 摘薹文中报道了本研究小组近年来在多倍体中华绒釜蟹(河蟹)研究中所取得的最新进展．针 对河蟹生殖生物学的特殊性，试验采用热休克和细胞松驰素B(c．B1二种处理方法，在人工授精 和体外培养受精卵的基础上，先通过诱导三倍体的筛选试验，求得适宜处理温度(和c．B溶液浓 度)与持续处理时间，再应用这些参数进行四倍体的诱导．从而有效地节约了材料和试验时间，并 大大提高效率．应用以上方法，实验除成功地诱导出一定比侧的三倍俸、四倍体旺胎外．还首次 以热休克方法培育出了四倍体潘状幼体．文中讨论了河蟹多倍体育种的关键技术和难点，并提出 丁有关对策。 关■词河蟹多倍体诱导 近20年来，水生动物多倍体育种技术出现了重大突破，应用物理学方法、化学方法和生 物学方法诱导水生动物多倍体，在鱼类和贝类的研究中得到广泛的应用(尤锋，1993；喻子 and 牛等，1995；楼允东，1984；A1Ien 1984)。与鱼类、贝类相比，十足类甲壳动物的多倍体育种起步较晚，及对十足类动物自身的 某些生殖生理学特殊性和细胞遗传学的研究极为缺乏，使得该领域的研究进展缓慢．至今仅 对二种十足类即中国对虾Pe”4e“s c^inen曲和日本绒螯蟹E砌c^e扣扣pⅫfc“5进行过多倍体 经济十足类中华绒螯蟹(河蟹)的染色体组操作育种技术，除本研究小组进行的试验工作外， 迄今尚无其它相关报道。河蟹是我国独有的水产珍品和重要的淡水渔业资源。近年来，因多 种原因，河蟹自然资源日渐衰竭，因而进行了蟹苗人工放流和小水体人工养殖。放流虽有一 定效果，但管理困难，产量无法保证；而小水体的人工养殖中，普遍存在一秋龄蟹性成熟和 二秋龄蟹育成规格小型化二大难题．同时，部分逃逸的～龄性成熟和二龄小规格蟹参与河蟹 种群，将成为导致其种质退化、变异的重要诱因。为了解决河蟹的性早熟和种质混杂而造成 的优良品种变异和退化等难题，我们于1992～1995年开展了河蟹的多倍体人工诱导研究，这 不但可为人工培育蟹类新品种提供一条有效途径，同时对资源保护和遗传育种研究也有重要 意义。 l多倍体操作的原理和方法 河蟹生理成熟的卵子停留在第一次成熟分裂中期(Lee，1989)，待受精后相继排出第一 极体和第二极体，从而完成整个减数分裂过程。然后雌雄原核以联合(Association)的方式完 ·本研究为上海市青年科技启明星计期基金(95QMHl408)资助项目． 950 成真正的受精作用，准备第一次卵裂(堵南山等，199z)。这一显著特征，对于藉助染色体组 操作进行育种，通过阻止第一极体的释放使染色体加倍，导致较大的遗传变异和杂合性具有 体及第一次核分裂发育阶段的时间分别比软体动物和中国对虾约长25分钟、2．5小时及8小 而对其染色体组复制时间的控制选择可能较为容易，且更有效。由此可见，要获得多倍体，可 在卵子受精后尚未排出第一或第二极体之前，或是在受精卵即将进行卵裂之时，用物理或化 学方法，阻止第一、第二极体的排放而成三倍体(triploid)，或通过抑制第一次有丝分裂而获 得四倍体(tetr8pl。id)。目前，河蟹的多倍体操作主要有以下二种方法。 1．1温度处理法 一般以高于或低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制极体排放)或四倍体(抑 制第一次卵裂)。温度处理法虽对受精卵的损害较大，死亡率往往较高，但如能掌握处理的开 始时间、处理持续时间以及处理温度这3个要素，则温度处理不失为一个简便而叉实用的多 倍体育种方法。从已有的研究结果来看，冷处理温度一般为o～5℃，热处理温度无统一标准， 随不同动物而异。本研究中，我们在卵子受精后(发育水温20士1℃)10～25分钟，用38～ 41_c的高温处理1～2分钟，获得的三倍体的平均诱导率为10％～50％，而对受精后30分钟 的卵子进行诱导，或在40℃下处理超过2．5分钟和处理温度高于42℃诱导1．5分钟的各试验 组，均未检测到有三倍体胚胎。嵌据诱导三倍体的适宜诱导温度和处理时间，将受精后8．5～ 9．8小时的卵子用40℃热休克处理1．5分钟，均获得了一定比例的四倍体胚胎，其中四倍体 最高诱导率为52．96％。检查卵受精后8．8小时经热休克处理所孵得的淹状幼体，其四倍的出 现频率约为1