蟑螂病毒基础和产业化研究的新进展.pdfVIP

蜂螂病毒基础及产业化研究的新进展 胡远扬 张伽敏 武汉大学生命科学学院武汉 430072 1.前言 嶂螂，其学名称为蜚蛾，属昆虫纲，直翅目，蜚镰科;是危害不亚于蚊 虫、苍蝇及老鼠的卫生害虫，也是防治难度最大的城市卫生害虫。嶂螂的繁 殖力极强，一只雌嶂螂在一年内可繁殖近万只后代。嶂螂是多种病原体的传 播媒介，其分泌物和粪便中尚含有多种致癌物质，对人类的健康已构成威胁。 它危害粮油食品、衣物和书籍等仓储物品，降低其品质，造成很大的损失。 它能够轻而易举地钻进大型电器、电子计算机、仪表及家用电器中咬毁线路， 造成意外故障。近年来宾馆、客机、列车、轮船中嶂螂也成为令人忧虑的害 虫，有效地防治蜂螂是巫待解决的国际性重要课题。 1991年，我们报告了从中国最常见的嶂螂种类一黑胸大燎(Periplaneta 户1心inosa)中，发现并分离蜂螂非包涵体细小病毒，将其命名为PfDNV, 这是国内外第一个正式分类鉴定的嶂螂病毒。我们对其进行了系统研究，包 括形态结构、核酸性质、结构多态、血清学、全基因组克隆载体构建、全基 因组核昔酸序列分析、组织病理、安全性测定、生物活性测定、毒力测定、 病毒拯救、体外培养细胞感染、病毒衣壳三维结构重构及信息素诱导的病毒 灭蜂剂构建等，使之成为目前世界上惟一一株进行了系统深入研究的蜂螂病 毒。 PfDNV呈典型的球状二十面体病毒粒子，以烟草花叶病毒作为内标测 得其直径为22nm。经甲醛处理过的PfDNV粒子，其最大光吸收值稍微偏移 到263nm波长处且较260nm的光吸收值明显增加，这是单链核酸的特征。 在高盐条件下提取PfDNV-DNA，以XDNA/HindIII片段为标准，在琼脂糖凝 胶电泳中侧得其分子量为5.5kb，经蛋白质单分子膜展层后，在电镜下，DNA 呈线状分子，其长度为1.8pun，相当于3.6X106Da，二者的结果十分一致。 PfDNV的结构多肤经SDS凝胶电泳测定共有5种，通过标准蛋白 计算其分子量分别为105K,82K,79K,56K和52K，虽然其分子量与目前 所报告的昆虫DNV略有不同，但仍然存在病毒多肤以两个双带分布的特征。 以SPF化豚鼠制备PfDNV抗血清，Western印迹反应证实PfDNV抗血清能 够与PfDNV的5条结构多肤带产生反应，其位置和带形与经考马斯亮蓝染 色的凝胶中的结构多肤一致。采用制备的PfDNV抗血清，通过琼脂板免疫 双扩散反应，证实它和有代表性的昆虫浓核病毒BnlDNV-1,BmDNV-2 之间没有免疫交叉反应。 我们构建了PfDNV全基因组克隆载体及系列缺失克隆载体作为核昔酸 序列分析模板，完成了嶂螂浓核病毒基因组全序列分析。PfDNV基因组全 核昔酸序列共计5454个核昔酸。它的GenBank登录号为AF192260。该序 列中(A+T)%含量为61.87%,(G+C)%含量为38.13%。通过分析发现PfDNV 基因组两末端均存在具有相同核普酸序列的 122nt.的回文序列形成典型的 发卡结构。已报到的其他细小病毒的发卡结构一般由120160个碱基构成， 整个发卡结构又被两个短的回文结构中断而形成 Y“，型或`T‘”型结构。而 PfDNV基因组末端回文序列无Y“，或T“型结构。PfDNV基因组的读码框架 与同属病毒比较后发现，有相当的同源性但具有自己的特点。以ATG为起 始密码，TAA,TAG,TGA为终止密码，对PfDNV基因正负链进行阅读框查 找，共发现 7个较大的ORF。正链有 4个大的阅读框 (ORFI,ORF2, ORF3,ORF4)，分别编码33,2,13,31ku的蛋白。负链上有3个大的阅读 框 (ORF5,ORF6,ORF7)，分别编码26,63,20ku的蛋白。正负链上的ORF 均集中在DNA链的5端‘一侧，并且有基因重叠现象存在。 通过BLAST程序将PfDNV基因组码的蛋白与NBRF蛋白数据库进行 同源性搜索，发现ORF2,ORF5,ORF6编码的蛋白与其他细小病毒有同源 性。其中ORF2编码蛋白82531氨基酸 (a)与蔗螟浓核病毒 (Diatraea saccharalisdensovirus,DsDNV)，鹿眼峡蝶浓核病毒 (Junoniacoenia densovirus,JcDNV)，大蜡螟浓核病毒 (Galleriamellonelladensovirus GmDNV)的非结构蛋白(NS蛋白)同源性较高;331-507aa与