猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建、鉴定和免疫原性的研究.pdfVIP

获奖论文 7 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白 重组腺病毒的构建、鉴定与免疫原性的研究 王先炜，姜平，李玉峰，蒋文明 南京农业大学农业部动物痰病诊断与免疫重点开放实验室，江苏，南京，210095 摘要：猪圆环病毒Ⅱ型(PCVZ)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的必需病原，舍有两个主 抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒 Western blot和IPMA等试验证明了Cap蛋白在腺病毒中获得稳定表达。将该重组病毒免疫普通小白鼠，用间接 ELISA和Western—blot测定其抗体，抗体滴度最高可迭1：12 800；用MTT法测定其淋巴细胞增殖，证明该病毒在二免 后20d左右能刺激鼠的淋巴细胞增殖。从而为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础，， 关键字：II型猪圆环病毒；Cap蛋白；重组；腺病毒；构建；鉴定；免疫原性。 猪圆环病毒(Porcine 决定簇，但血清学却显示它们的Cap蛋白没有抗原交叉性。通过多肽扫描分析在Cap蛋白中已经鉴定 肾细胞(PK一15)中发现并分离获得。用PCV一1感染猪后不出现临床症状，因此认为它无致病性，在 weani,ng wasting muhisystemic 碍等。PMWS于1991年在加拿大首次爆发，随后世界上许多国家和地区都有报道，主要感染断奶仔 猪，以发热、渐进性消瘦、呼吸困难和黄疽等症状为特征，死亡率5％一30％，给养猪业造成严重的经济 损失。 PCV2基因组为一条长约1．76kb的单股DNA，含有两个主要的开放式阅读框(Openreading 蛋白)，是病毒的主要结构蛋白，分子量28～36KD，可诱导机体产生免疫保护作用心，3|。本研究将 PCV2的cap蛋白基因重组人人腺病毒中，构建了c印蛋白的重组腺病毒，为研制安全有效的PCV2 重组腺病毒基因工程疫苗奠定基础。 1材料与方法 1．1细胞与病毒 HEK一293A细胞(本实验室保存)；PCV2分离株SHHTl(本实验室分离保存)。 1。2 P(、R扩增嗍Cap蛋白基因 5 8 2005学术年会 TAT TCC CTT CCT T11T gg!垒鱼垦AgCgAC gTA AAg 3’，弓l物2：5’gCC△垒g垡!!TCA CgT ggT 58。C，40s；72。C，1 rnin，35次循环；最后72。C作用lOmin，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。 1。3重组腺病毒rAd—Cap的构建与鉴定 I／Hind 1]I双酶切及测序分析进行鉴定，将阳性质粒命名为 体pShuttle—CMV中；用PCR、Kpn rShuttle—CMV—ORF2；用Pine Weetor在25kV、 I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与DAdEasvTM 脂质体转染试剂操作方法，将用Pac C02，37。C静置培养lOd以上，显微镜观察有无病变。 1。4重组腺病毒Cap蛋白表达的鉴定 1．4．1 4．o弘l；dNTP (10Mm)0．5}tl；tuRNA 浴60rain。按上述方法进行PCR反应。 被于96孔酶标板；用2％明胶作封闭液，加入lOOt—tl 为1：10000稀释的SPA—I-IRP(武汉博士德公司)，底物为OPD，终止液用2M