微生物来源的Factor+Xa抑制剂F02ZA-2172地研究.pdfVIP

微生物来源的Factor Xa抑制剂F02ZA-2172的研究 路新华郑智慧马瑛石英董悦生任晓穆栋金莹张华贺建功 (华北制药集团新药研究开发中心微生物药物国家工程研究中心石家庄050015) 摘要本研究利用一种由本室建立的精确、快速的高通量的FactorXa抑制剂的体外筛选模型， 从大量真菌中筛选到一株阳性菌株F02—2172，该菌株的发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱色谱、ODS 柱色谱、Sephadex K， 其紫外、质谱、核磁等理化数据分析，确定这三个化合物分别与已知化合物6-epi—ophiobolin K， G结构相同，但该类化合物对FactorXa的抑制活性至今未见报道。 ophiobolinophiobolin Factor 关键词 Xa抑制剂 血栓的形成是一些心血管疾病，如心肌梗死、中风、深度静脉血栓、肺栓塞等的重要致病因素， 抗血栓治疗一直是这类疾病抢救措施及预防策略的核心，抗凝血是抗血栓治疗的重要方法之一。寻 找更加安全高效的抗凝血药物具有重要的意义。 因子Xa是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共 同通路的中心位置，Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生【11。Xa因子是 凝血酶生成的限速成分，由于在血液凝集级联反应过程中还存在生物信号的放大，估计一个Xa因子 抑制剂分子能抑制138个凝血酶分子的生理效果，Xa因子抑制剂可能比凝血酶抑制剂更为有效【2】。 Xa因子只单纯促进凝血，没有凝血酶抑制剂的副作用，因此，Xa因子抑制剂成为近年来抗凝血药 2001年12月在美国获得FDA批准)【31或正在开发中‘】。 本实验室建立了一个快速的高通量筛选方法，从大量土壤真菌代谢产物中筛选Xa因子抑制剂， 筛选得到阳性菌株F02．2172。本文报道其发酵、分离、结构鉴定和生物学活性。 1材料与方法 1．1筛选用微生物的菌株 真菌菌株由本室从云南和新疆采集的土壤中分离得到。 1．2试剂及仪器 X 酶(Factor hydrochloride)购自美国Sigma公司；色谱乙腈购自Merck公司； Victor2多标计数仪(美国PE公司)； 中压层析系统(德国BUCm公司) 高效液相系统(美国Waters公司515泵和996光电二极管阵列紫外检测器) 高效液相柱：Kromasil 10口m IOOACl84．6X250ram，Phenomenex C1820X250ram 质谱仪(Autospec．Ultima)，核磁共振仪500MHz(Inova) 1．3Xa因子活性测定方法 237 活性测定方法由本室建立，原理是factor xa可以水解特定的荧光标记多肽底物，通过荧光值的 变化计算抑制剂对酶的抑制活性。 测活反应在96孔板进行，样品孔中加入：0．IM X 酶液(Factor 100％ 样品抑制率=篙糕器x 各孔加入底物，37。C保温lhr，测荧光F2。其中，抑制率大于80％的样品为阳性。 1．4真菌F02．2172的培养 0．1％，NaCl 酵母0．5％，CaC030．2％，MgS04·7H20 按1％接种的量接种到固体培养基(大米97．5％，黄豆饼粉2．5％)27。C培养14天。 1．5 F02ZA一2172的提取分离 上述粗提物经硅胶柱(巾2．6×50cm)色谱，正己烷．乙酸乙酯梯度洗脱，每50“收集一管，合并活 ODSC18，40lam，由1