微生物发酵法生产血栓溶解酶地研究.pdfVIP

第二届全国发酵工程学术讨论会论文集1998 微生物发酵法生产血栓溶解酶的研究- 杜冰 路福平 王昌禄 杜连祥 (天津轻工业学院食品工程系天津300222) 摘要 以一抹具有高产纤溶酶能力的菌株一中国根霉12‘为出发菌株，以麸皮胰蛋白胨 为培养蓦，采用液体发酵法生产高教血栓溶解酶．用人工血纤维蛋白平授检测其活性．对培 养基中的碳源、氯源、浓度及配比进行了研究，通过正交试验设计了最佳培养基配方和培养 条件，并进行了扩大培养实验． 关键词血栓溶解酶。发酵，培养基 血栓栓塞症是血管系统内由于血液本身组成物形成肿块，造成某处血管闭塞所导致 的一切病变“’，据统计。由血栓拴塞而引起的死亡率约占整4-A．1：3死亡率的l／2以上． 目前，对血栓栓栓塞症的治疗方法主要是使用溶栓弗J使血管再通．我国临床上常用药品 有尿激酶(U】p和链激酶(SK)。它们可以促进血液中血纤维蛋白溶酶的形成而加强对血栓 的溶解．但SK的抗原性强，连续用药不能超过7d；UK虽可连续使用半个月而无抗原 性，但在体内的半衰期短，只有3—20min，并且长期大量用药则有全身性出血的倾向， 口服一般无效．我国于1984年获准生产的蝮蛇抗栓酶，具有抗凝，溶栓、去纤等多种 功能，但临床上仍伴有许多不良反应，如一般的发热、头痛，过敏性休克、多脏器出血 等等“1．日本1991年上市的组织血纤维蛋白溶酶原激活荆(t-pA)，能选择性地将血栓 中的血纤维蛋白溶酶原变成血纤维蛋白溶酶而使血栓溶解，在没有血栓时几乎无此作 用，而且不伴有全身性出血的倾向，但缺点是半衰期短．随后开发出的第二代t-pA即 M-tpA，将其在血液中的半裹期提高了10倍．美国生物遗传科学公司(ABe公司)成功地 开发出具有良好血栓溶解作用的单克隆抗体MH-1，能特异性的识别血栓中主要成份一 血纤维蛋白，并显示出高度溶解作用“1．上述几种制荆给药方式均为静脉注射或点滴， 口服几乎无效，且对制剂的要求特别商，价格昂贵．最近，我国临床上有口服蚓激酶和 水蛭素等报道，但应用效果也不佳。近来日本报道了两种激酶即纳豆激酶(Natokinase)和 天醅激酶(TcmlⅪhkinase)，它们分别来自于日本的传统食品一纳豆及印度的传统食品一天 醅，长期食用这些食品便能达到“经口纤溶疗法”的目的，作用时间也很长(8d)且 分子量小、易于吸收、对人体不产生任何副作用”1．本文论述了以选自于南方小酒药 的～株根霉菌一中国根霉12。为出发菌株，对其溶栓作用．检测手段、发酵培养基的组 成等进行了研究． 1、材料与方法 1．1菌种 中国根霉12号(Rhizopussp,12’)，由天津轻工业学院微生物研究室提供． 1．2培养萋 制备：取1009黄豆加1000ml水，浸泡l天，煮沸l小时，取汁)． 1．2．3种子培养基：营通蛋白胨1．5％，3％麸皮水-pH5．0(麸皮水制备：39麸皮加水 100m1，浸泡1小时，煮沸1小时，取汁)． 1．2．3发酵培养基：普通蛋白胨0．75％，胰蛋白胨O．75。3％麸皮水，pH5．5。 +天津市2l世纪青年科学基金资助项臣 第二届全国发酵工程毕术讨沦会论文集 1 998 1．3培养方法 将在孢子培养基上28℃培养7D的新鲜菌丝体和孢子接种到种子液体培养基中，28 ℃发酵60h后测pH值及溶栓活力． 1．4主娶试剂 牛血纤维蛋白原、牛凝血酶及琼脂糖均为Sigma公司产品．其它试剂为国产分析纯． 1．5方法 1．5．1人工血纤维蛋白检测平板的制备”。： 巴比妥钠：0．1mol／L 凝血酶溶液与5ml血纤维蛋白原溶液混合均匀，然后快速倒人09锄平皿中，水平放置 30rain后放人冰箱中备用。使用时将过滤后的发酵液15山以小滴形式滴至平板上，37 ℃下水平放置18h，测其透明圈直径大小． 1．S．2麸皮水与蛋自胨浓度(cfN)对发酵的影响： 分别采用麸皮水浓度为3％、4％．5％及酱通蛋白胨浓度为1％、1．5％、2％， pH值自然(5．o)的培养基．发酵结束后取样检测溶栓能力及pH值． 1．5．3不同种类蛋白胨对发酵的的影响： 以3％麸皮水+1．5％普通蛋白胨与3％麸皮水+1．5％胰蛋白胨为培养基，发酵结束 后比较其溶栓能力太小． 1．5．4正交试验： 选培养基组分(氮源)、初始pH、通风量为三因素，作三因素三水平