SPA-ELISA检测大豆种子携带SBMV的研究和应用.pdfVIP

SPA—ELISA检测大豆种子携带SBMV的研究及应用 谷建夫 陈建宏 郭京泽 罗弘鑫 范晓红 张作芳 张成良 (天津动檀簪检疫局．天聿300457) (农韭眷■檀赛■所) 蠢要植精种子较叶缸织中蛋白、避粉、内聋啡午干扰轴质多，病毒奢量截。在ELISA柱谢中常产生 杜强的非特鼻应应．这是影响ELISA竹子t康挂●的关键问毫．解决遗一同志：第一要宥禹蒋度，高 记轴衄虎的一种妻缸鼻种动轴蕊抗体夫心法甘方法，宦浦肇1阉甚法中种干建立接邑麓时砷目的冉毒 洗有琏释吸附曲并^，在保甘愿抗失心法曼鼍度的朋．时，免跨了科●雨竹抗体竹鼻炳，便于在赛蓐中应 用．钟对上述同意，毫安■通过人工摹粗的方法，斗SPA—ELISA量■土立竹于内南帝蕈．I花叶冉毒 (SBMV)时的诸影响霉蠢进行1实薯分析。得出样茹|-曩i且度为干种子t量的1-20(V／W)．抽曩疆 冲液是PBsTP(pHl7．4)，尚质量的抗▲清无需基健康种子澶囊处理}抗蜃孵育时问为37℃3小时．用 置适宜目素n成的,,s]PA-ELISA的曼敏度为8叼／Ⅱd，并健^琦的应用于种子单粒和20粒以内种于混合 ‘ 样品的检测． 关■调SPA—ELI,SA牲洲种亍SBMV l材料与方法 1．1摄纯瘸毒 SBMV接种于大豆(G／yc／wⅢ∞)。猴子毛”上，置防虫温室，新鲜病叶粗提澄清液，经PEG 沉淀、两次超离、一次梯度离心得到握纯病毒．用紫外分光扫描、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和电 镜观察3种方法同时检测合格． 1．2棚鲁SBMV抗血清 微量免疫法制备兔抗血清。1．1ing病毒分5次免疫，每次间隔10天t最后1次免疫12天后 000． 采血，得到的抗血清的璩脂双扩散效价为1／12．8。间接ELISA的酶联效价为]／500 1．3 A蛋白纯品(SPA)和■标A置白(HRP-SPA) 上海捷门生物技术公司生产的市售的产品．SPA的工作浓度是2．5pg／ml，HRP-SPA的工作 40。 浓度是ll I．4 SPA—ELIsA的程序 2结果及分析 2．1抗血清在SPA—ELISA适宜工作浓度的确定 z l t ●j{lf{{{ft{‘ 10000～1 000 500 80 000。根据此值，抗血清做1 该抗血清在ID-ELISA的工作浓度是1 稀释分别作包被抗体和检测抗体，组合方阵，以浓度lOv-g／ml的纯病毒作检测对象，实验结果为： t 10000～1：30 OD值只随检测抗体的浓度降低而降低，适宜工作浓度在1 000之间I同一检溯抗 616 l l 体浓度下，包被抗体1 10000～l8000 0000D值无明显变化。 、 故哲选lt 40 t 5 l 10 t 000作为包被抗体，与l000、1 000、1：20000、1；4 000