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疫瘸墒原前的流行病学监测是一个有力的工具。
北京地坛医院(100011)肖元朴 丰正谦
染所致的累及中枢神经系统的严重}芫病，为使乙型脯炎的研究进入到基目水平，本实验蹦克隆的
JEV特异的1．1kb
及应用。
材料和方法
一、材料
1．1kb，克隆到PER质粒戴俸上。
2．Sa—dATP为英国Amorsham公司产品。
3．乙脑强毒株SA由医学科学院病毒所提供。
4．实验小鼠为5～79的纯科叫、白鼠．
供的进口或国产产品，分析境缎。
二、细胞转让
(一)感受态细胞制备．根据Cohen等方法改良。
37℃剧烈振摇培养3小时，淀4。值≈o．6。
C。
2．取50ml，在冰上设置10分钟．使培养物冷却列o
3．4℃40000r／min离心10分钟，去上清液，回收细胞。
4．以10mi用冰顶冷的0．1mol／LCaCI：重悬细胞。
S．4℃4000r／rain离-g-10分钟，击上清．回收细胞．
6．以2ml冰预冷的0．1mol／LCaCI：重悬细胞。
(二)转化
。
10刖。DNA50ng)，混匀，在冰上放置30分钟。
2．将管放置于42℃水浴中90秒．
。·：’
3．快速将管移到冰浴中，使细胞冷却l～2分钟。
(200r／min)． ‘：峙鐾：矿
一60一
黎盛
5．将适当体积已转化的感受态细胞转移刮含200pg／ml氨苄西林的LB琼脂培养基上。
6．室温至液体技吸收．倒置于平皿，于37℃培养12～16小时。
25mmol／LTris
钾、60ml，冰乙酸11．5ml，H：O285m1)。
将一转化培养的单苗落接种到2ml含200．g／ml氯苄西林的LB培养罄中37℃振摇过夜．4℃
l 2
200vl溶液I，充分混匀衍置于冰上。加1SOoI用冰预冷的溶液I。℃12000r／min离心，留上清。酚
一氯仿抽提、乙醇沉淀。过夜。干燥后用20．1TE重溶核酸。再用EcoR1酶消化质粒核酸，1．2％琼脂
Lnd
培凝胶电泳．缓冲液为TBE。用EcoRI／III酶切片段作分子量标准．电泳带为两条，一条为
1．1kb
cDNA，另一条为约3．62kb，是PBR线性质粒。
三、探针制备
羟基磷灰石吸附层析进行过柱．用0．2mol／LNaClTE(pH8．0)透折以去除磷酸盐，透析后甩2体
积乙醇沉淀DNA．
2．eDNA片段回收：提纯的质粒DNA用EcoRI酶消化后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳，切下包
含1．1kb片段胶块，加5倍体积20mmol／LTris
65℃5分钟溶解凝胶后．用酚、酚一氯仿、氯仿抽提，上清液加0．1体积3mol／LNaCI．2倍体积乙醇沉
淀．离心干燥后溶于TE缓冲液中，终浓度为0．2ug／ul。
3．JEV探针环记：(1)”s探针拆记反应：用切口平移法硫标记JEVeDNA．参照产品说明书推
Buffor I
荐方法。反应在冰浴中进行．混合试剂：dNTP(无dATP)各201．10×Mek2．50l、DNase
1
Pol dATP
Ipl，DNA0．50l，DNAPOILF0．5Pl，“Slopci咖I(为501)，加水7
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