RAPD技术在葡萄研究上应用.pdfVIP

(拓凌，2001r 4．20-22 Y蚰gIin岛20_2王Poll．2001) RkPD技术在葡萄研究上的应用 惠竹梅张振文刘延琳张艳芳 西北农林科技大学葡萄酒学院．陕西杨凌712100 摄要本文简要介绍了RAPD的特点及其在葡萄分子遗传图潜构建、目标性状基因定位、 种属特异性鉴定及遗传多样性分析方面的应用a 美翻一RAPD；葡萄；7{辇多， 建立在DNA水平之上的分子标记的出现，有利于辅助育种、简化选择，对无性繁殖的 果树有很大帮助。近10多年来，分子标记技术得以迅速发展和应用。目前较广泛应用的分 等和加尼福利亚生物研究所的Welshl2]等在1990年同时推出的RAID技术，现已在果树上 得到广泛的应用。本文就其在葡萄上的应用进行简要地综述。 1 RAPD技术概述 RAPD‘。1(Randomly PCR) AmplifiedPolymorphicDNA)又称AP托RqA埘昀珂_Ilrimed Chain 和DAF【“(DNA Reaction)技术 基础之上，通常采用一个随机的10个碱基的寡核苷酸为引物(而AP-PCR多用20个碱基的 寡核苷酸为引物，DAF以5-8个碱基的寡核苷酸为引物)，通过PCR循环．对所研究基因 组DNA进行扩增，产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用澳化乙锭(EB)染色后， 在紫外透射仪上检测其扩增片段多态性。 RAID继承了PCR的优点，而且克服了PCR的某些缺点。PCR要求预先知道待扩增区 域两端的核苷酸序列，需要设计与之互补的引物．而RAPD应用随机引物。PCR退火温度 子标记相比也具有独到的特点和优势：(1)合成—套引物可以对没有任何分子生物学研究的 物种进行DNA多态性分析。构建这些物种的基因图谱．不具种属特异性；(2)无需制备克 隆、标记探针、Southean印迹、分子杂交等工作，简便迅速，实验成本低；(3)样品用量少 (通常为15—25ng)，灵敏度高；(4)无放射性污染。 RAPD虽然具有以上优点．但也有自身的缺点．主要表现在：(1)显性标记，即多数位 点的标记带表现为显性的特点，无法在B代中区分纯合显性或杂合体的基因型，因而不能 提供完整的遗传信息141；(2)再现性差．这就需要研究者对不同物种做大量的摸索工作，以 确定每一物种的最佳引物和实验条件。只有实验条件标准化，才可能提高RAPD标记的再 现性。此外，如DNA浓度、Mg“攘度、聚合酶种类及浓度等也影响RAPD反应。 2葡萄RAPD优化反应体系 RAPD对反应体系要求较严格，扩增反应各成分的变化都可能影响到扩增结果。因此， 有必要对影响RAPD反应体系的主要因素进行比较试验，确定最优的反应体系。罗素兰口1 用改良的CTBA法提取葡萄不同种的基因组DNA，通过正交设计对葡萄RAPD反应体系进 行初选与复选，建立了优化的RAPD反应体系：251l总反应体积中，模板DNAl0--20ng， dNTPsl50--200I l均能 扩增出较好的条带，采用低限浓度扩增效果最好、最经济，节约简便。王军(q等以香妃，山 11 辩二强国酥蔼蔼与葡萄梧学术番}讨会论文集Proceedfngs (橱睫，200t．4-20-22 YⅡ曲＆20-22。April．2001) 体系：loi lOOng明胶。这些都可以作为DNA分子标记的参考资料。 3 EAPD分析技术在葡萄上的应用 3．1分子遗传图谱的构建 在果树育种中，早期选择更具重要的意义，分子标记辅助选择可大大提高选择的准确性 和育种效率。因此，用RAPD寻找与目的基因(性状)紧密连锁的分子标记构建连锁图谱 乃是辅助选择的关键。目前．单独应用RAPD标记或与RFLP和同工酶标记相结合