甘露糖基转移酶基因导入棉花基因组地研究.pdfVIP

58 中国棉花学会2005年年会暨青年棉花学术研讨会论文汇编 甘露糖基转移酶基因导入棉花基因组的研究 高大玉，杨业华。范玉朋。王学奎，戴宝生．姚明镜，吴征彬 (华中农业大学植科院，武汉430070) 摘要：通过农杆菌介导法将拟南芥甘露糖基转移酶基因的三种转化结构即花药特异启动子Ms2P— 明，陆地棉基因组中存在至少4个拷贝的与拟南芥甘露糖基转移酶基因有同源性的序列。从T，代群 体中分离到纤维长度得到明显增长的株系和完全雄性不育的材料，经初步鉴定，这些材料对棉蚜和白 飞虱具有很强的抗性。 关键词：陆地棉；遗传转化；甘露糖基转移酶基因 甘露糖基转移酶(mannosyl 产物的基本功能是将甘露糖从GDP．甘露糖转移到长醇一磷酸酯上，形成长醇磷酸甘露糖。在内质网 泡内，长醇磷酸甘露糖是N．糖基化途径、糖磷脂酰肌醇膜固定途径以及蛋白质的0一甘露糖基化的甘 露糖基的供体。甘露糖也是聚唾液酸和植物外源凝集素的成分，而这两种甘露糖蛋白又是植物的细 胞壁成份之一，都与植物的抗虫和抗病性有关。因此甘露糖代谢异常，也会导致植物对病原微生物及 害虫抗性特征的改变以及植物本身生长发育的异常。本研究利用源于拟南芥的mant基因的编码序 列与花药特异启动子Ms2P、含增强子四联体的花药特异启动子构建成融合基因和该基因的反义 RNA基因，并通过农杆菌介导法将这些融合基因导人棉花基因组中，使其超表达、花药特异表达或抑 制棉花同源基因的表达，通过扰乱棉花正常的代谢活动，以期创造出新的抗病、抗虫和转基因雄性不 育系。 1材料和方法 1．1实验材料 1I)基因，作为转化体 根癌农杆菌菌株为AgLl，其所含载体pBinplus带有新霉素磷酸转移酶(npt Ms2P一反义mant RNA三种转化结构。作为转化受体材料的棉花品种为鄂棉18、华抗棉1号。 1．2实验方法 棉花的遗传转化按刘海燕、杨业华等的方法进行。经过初步筛选的转基因苗通过嫁接定植到田 间。转基因植株的PCR检测、Southern杂交方法参照《分子克隆实验指南》。 2 结果与讨论 通过农杆菌介导的遗传转化方法将甘露糖基转移酶基因的上述三种转化结构成功导人棉花基因 组中，共获得66株卡拉霉素抗性的阳性植株。分别以nptII和mant基因序列设计引物，对获得的当 株中，通过两对引物筛选的阳性植株有48株，占72．7％，两对引物筛选的共阳性植株有24株，占 50％。这一结果表明，所有卡拉霉素抗性植株中，有一部分为假阳性，占27％以上，但假阳性植株的 比例在不同选择压条件下变化较大。在一定条件下，一般选择压愈高，选择时间愈长，假阳性植株的 1I和mant基因在转化结构中是两个紧密连锁的基因，由于共阳性率只有50％，表明在 频率愈低。npt T．DNA的整合过程中转化结构中发生缺失或重组的频率较高。 内切酶EcoRI和KpnI切割，同一张杂交膜先后以nptII和mant基因的PCR产物为探针，以检测T． 59 中国棉花学会2005年年会暨青年棉花学术研讨会论文汇编 II基因的PCR产物为探针的两种酶 DNA的多态性和预期内部片段的存在与否。结果显示，在以npt 切结果中都出现了2～4条杂交阳性带，这种多态性表明T0代转基因植株可能起源于2个以上转化 细胞，在不同转化细胞中，其插人位点不同。在以mant基因的PCR产物为探针杂交实验中，转基因 植株的EcoRI酶切片段中呈现出5条杂交阳性带，其中一条2．4kb的片段为预期目的基因的内部片 段，非转基因的对照DNA有4条杂交阳性片段，其大小与转基因植株的其它4条片段的大小一致，而 且在以KpnI的酶切实验中也得到相似的结果，证明陆地棉基因组中存在与拟南芥甘露糖基转移酶基 因具同源性的拷贝。虽然在mant引物的PCR分析中只有特异性片段，并未检测非特异性带，可能原 因是棉花基因组中甘露糖基转移酶基因的DNA序列与引物对序列的同源性程度较低。 在T0代转基因植株中并未观察到在表型特征方面有明显变异的单株，但在纤维长度方面则