β-catenin干涉质粒的构建与抑制U251细胞增殖的实验研究.pdfVIP

·84· 生垦医蠼协会整丝处登医埂盆全==缝四旦全垦』殳差盔金迨塞堑绽 B—catenin干涉质粒的构建及抑制U25l 细胞增殖的实验研究 段晓春武永康董伦李瑶瑶王晓东 张恒柱 catenin是一重要的细胞粘附分子和细胞骨架成分，同时又是wnt信号通路中的一个重要组成部分。B —catenin在发育过程中指导机体的正常发育，在肿瘤细胞中，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。近年来国 内外研究证实在多种肿瘤组织中B—catenin的表达增高，并且和肿瘤的恶性级别呈正相关。国内学者 研究表明B—catenin在不同级别的胶质瘤中均表达异常，Ⅳ级的胶质瘤中几乎100％表达。这与本课 涉质粒，进一步对该基冈的作川进行研究。 资料与方法 1．材料：神经胶质瘤细胞系U25l购自上海中国典藏细胞中心，大肠杆菌DH5d由扬州大学医学院 2000 (LipofectaminTM Kit GelDNAPu“6cation PstI和Bbs Ver2．O)、T4 I)、DNA电泳标准、DNA胶回收纯化试剂盒(Agarose 公司。 Design．htm)辅助设计，选取 则，通过眦ara公司在线设计软件(http：／／州mtakara—bi0．co．jp／siRNA cA 司合成。 为20 G， 5一、BbsI酶，2¨l、BamH GelDNAPu商cationKit 时，琼脂糖电泳，使用Agamse Ver2．0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至 作者单位：22500l扬州大学临床医学院神经外科(段晓春、武永康、董伦、王晓东、张恒柱)；扬州大学附属泰兴医院(李瑶瑶) 生国匿监逝金煎经处登医垣坌金==筮璺厦垒垦盐麦盔金迨塞堑缉 -85· 50 Ligation I+BamH ng／山。取10×T4 Bu虢r，2斗l，pGPU6／G胛／Neo(BbsI)，1止，shRNAtemplate DNA (20nM)，lpl，T4lig嬲e(5 应2小时。 培养基平板上，37摄氏度培养18小时，各挑取6个菌落，接种到含50峭／mlKan舢ycjn的LB液体培养 基中摇菌过夜。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用B舢HI，Pst1分别酶切鉴定。阳性重组载体应该 可以被BamHI切开，而不能被PstI切开。每一种载体选择两个克隆进行测序上海英骏生物技术有限 公司鉴定。 素)在37℃的5％co：孵箱内培养细胞，复苏后在4周内朋于实验研究。 x 6．质粒转染：在转染实验前天接种细胞，6孑L培养皿(35mm)，每孔2ml培养基3105细胞。转染 前一天更换无抗生素，有血清培养基培养细胞，转染当时培养皿中细胞密度～般控制在70％～80％。 转染当天，加入脂质体／DNA混合物之前的短时间内，更换lml新鲜的无血清培养基。按照之前预实 验结果用脂质体“pofec￡aminTM2000 进行质粒转染。转染结束后放人37℃的5％co：孵箱内培养细胞。5小时后，加入2～3ml新鲜生长培 养基。次日更换新鲜含10％小牛血清培养液培养液，再培养48小时后，收集细胞做以下检测。转染设 蛋白的表达，以评价转染效率。 7．westenl 提取细胞总蛋白，加等量的蛋白样品于sDS—PAGE凝胶电泳至溴酚兰到达凝胶底部停止。利用电转 仪将蛋白转移至硝酸纤维膜上进行蛋白免疫检测．一抗为1：100，二抗为1：500。具体方法见文献。