Nogo—A蛋白在正常新生大鼠中枢神经系统的表达与意义.pdfVIP

泛珠三角围产医学会议 会议交流 Nogo—A蛋白在正常新生大鼠中枢神经系统的表达及意义 周晓光‘，刘仁红2，黄嘉言。，熊爱华3 3．暨南大学药学院，广州510632) Nogo—A是在中枢神经系统外伤后具有轴突再生抑制作用的因子，被称为髓鞘相关蛋白 (myelin—associated 研究发现，Nogo—A在鼠胚神经组织中，海马、皮质的梨状细胞层、红核和动眼神经核中均 有明显的表达，在其他组织系统如肌肉、睾丸和心脏也发现有表达。深入研究该因子在新 生动物中枢神经系统的表达具有重要意义。近年也有关于成年动物Nogo--A表达与分布的 报道，但目前尚未见对Nogo—A在新生哺乳动物中枢神经系统分布及其作用的相关研究报 道。本研究采用免疫组织化学染色法研究Nogo—A蛋白在新生大鼠脑内的表达与分布，从 而为其功能研究及新生儿缺氧缺血性脑病的研究提供相关资料。 材料与方法 一、实验动物 7日龄新生SD大鼠30只，体重13．1±1．4 g，雌雄兼用，由广东省医学实验动物中心 提供。 二、主要实验仪器及试剂 Nogo—A抗体及SABC免疫组化检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供；DAB 显色试剂盒由福州迈新公司提供：冰冻切片冷冻包埋剂OCT由广州华俊公司提供；冰冻切 片机为英国珊顿公司生产。 三、动物分组与处理 取生后7天SD新生大鼠30只，按时将动物经心脏灌注固定，即从左心室进针插入主动 脉，同时剪开右心耳。先灌注生理盐水，流出液清亮后换为多聚甲醛。灌注固定完毕，即分 离大脑、小脑、脊髓组织。将标本分为3组：大脑组、小脑组、脊髓组，分别放入4％多聚甲 醛溶液中后固定24h，再经10％、20％、30％蔗糖多聚甲醛溶液依次浸泡至沉底后，冰冻切 片。然后挑取完整组织切片行免疫组织化学染色。 四、免疫组化检测 用漂浮法进行Nogo—A蛋白的免疫组织化学染色，步骤如下：①30％H：0：l份+纯甲醇50 358 泛珠三角围产医学会议 会议交流 份混合液，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶；②蒸馏水洗3次，滴加5％BSA封 闭液，室温20min；③甩去多余液体，滴加适当稀释的一抗(抗体的稀释度、孵育时间和 温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和 延长孵育时间：背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间)。37℃1小时左右或20 ℃时2小时左右，也可4℃过夜；④ess(pH7．2～7．6)沈2min×3次，滴加生物素化山羊 20min；@PBS(pH7．2～7．6)洗2min×3次，滴加试剂SABC，20～ 抗兔IgG，2037。C 37℃20 minX4次，DAB显色，镜下控制反应时间，一般 rain：⑥PBS(pH7．2～7．6)洗5 显色20～30min，若无背景出现则可继续显色。⑦PBS洗涤，裱片，晾干，脱水，透明， 中性树胶封片。为检验本实验的专一性和可靠性，同时用PBS代替一抗作对照，结果为阴 性。 五、图像采集及统计学处理 采用捷达JD801形态学图像分析系统Versionl．0进行图像采集与分析，并在高 倍视野(5．5x40)下对每张免疫组化染色切片的阳性细胞进行计数，采用SPSSll．5进 行统计分析。参照国外的文献瞳1，阳性细胞表达强弱用加减号来表示，其中+++代表 强；++代表中度；+代表弱；一代表无表达。其阳性细胞数15个为强表达，5～15 个为中度表达，1～5个为弱表达，找不到任何阳性神经元则为无表达。 结 果 一、Nogo—A蛋白在大脑的表达 新生大鼠脑组织切片经Nogo—A免疫组织化学染色后，在大脑皮质(图1)及海马、齿 状回(图2)中神经元高度密集，在神经元胞浆及突起内出现较强的阳性反应，阳性物质呈 棕黄色，而胞核为阴性。 Nog