人肝癌凋亡细胞cDNA文库构建与其细胞凋亡相关基因的筛选.pdfVIP

人肝癌凋亡细胞eDNA文库构建爰其细胞凋亡相关基因的筛选 107 人肝癌凋亡细胞cDNA文库构建及其细胞 凋亡相关基因的筛选 王文亮扬帆马运国张晓东 细胞两亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程，由一系列有关 的基因协调控制，这些基因被称为凋亡相关基因Ll J。深人研究这些基因对揭示肿瘤发生与发 展有很大的帮助，并为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径。我们以人肝癌细胞株HC_℃-9204为 实验对象，采用多种方法(如阿霉素、紫外线等)成功地诱导了H(℃-9204肝癌细胞发生凋亡。 库，进而筛选肝癌细胞凋亡相关基因。 材料与方法 h 后撤走，加入含有O．5tag／ml放线菌素D的完全堵养基继续培养5h，收集凋亡细胞(约1×108 ATtractmRNA 个)，磁珠法提取其mRNA(poly Isolation，Promega 上EcoR 库滴定和鉴定：取100 Y1090菌混合，铺于LB平板中(含 m稀释后的噬菌体Xgtll，与100td 大小。 进行。 3．eDNA文库筛选采用消减杂交和点杂交法相结合筛选，简要步骤如下：①噬菌斑原位 杂交，按文献[3]方法进行。按1×103～2×103个噬菌斑／150H1m平皿的密度板，共10个平 ml 挑取与X片相对应的阴性各噬菌斑并编号，分别置于50SM中。4C放置1～2h，待噬菌体 从琼脂糖中释放出来后，取各编号管的阴性噬菌斑稀释液10Ⅱd点在硝酸纤维素滤膜上，与人 性的噬菌斑，分别按50个噬菌斑／90nn平皿的密度重新铺板，挑取充分孤立的噬菌斑并编 本课题受国家自然科学基金项目资助(No 作者单位：710032西安，第四军医大学肿瘤研究所 108 中国癌症研究进展@ 3’，下游引物为5’rmACACCAGAOCAACr鲫AAⅢ0GTAGCG37。其中的一个克隆，PCR 法标记探针，克隆间杂交。分别提取阳性克隆的噬菌体DNA，PCR扩增插入片段。 mmol／L dTTP，2U 4．制备T载体Sinai酶切pGEM3ZI(+)，酚／氯仿抽提后，加2Taq DNA聚合酶(华美公司)，70℃，2h，酚／氯仿抽提后，溶于蒸馏水。 5．连接提取质粒，酶切鉴定，采用质粒双股DNA双脱氧法测其DNA序列。 结 果 梯状带”，说明此时已有凋亡发生，紫外分光光度计下对提取的mRNA进行定量，mRNA为 90％以上。用kgtll通用PCR引物做重组体PCR扩增，结果插入片段长度90％在1kb以上。 肝癌凋亡细胞的eDNA探针杂交，得到8个只与肝癌凋亡细胞的eDNA探针杂交的克隆。将 该8个克隆中阳性反应最强的2个，分别低密度铺板，挑取充分孤立的单个噬菌斑，分别点膜 后，第二次分别与肝癌细胞的c亡)NA探针和肝癌凋亡细胞的cDNA探针杂交，得到2个强阳性 克隆和2个弱阳性克隆，PCR分析其插入片段长度，均为1．5kb左右。插入质粒载体后测序， 其部分核苷酸序列如下： ． ． 翻删心开删ag(：}矧GCn舅二4丁G44CG硎fj别C， 讨 论 本研究是在建立了肝癌细胞凋亡模型的基础上Ⅲ，构建了肝癌凋亡细胞的；蟾tll