脑血管痉挛中差异表达蛋白质的实验的研究.pdfVIP

·487· 脑血管痉挛中差异表达蛋白质的实验研究 宋湖平 洪涛 陈红伟 叶新运 曾而明 脑血管痉挛(Cerebral vasospasm，CVS)是蛛网膜下腔出血后常见而又严重的并发症，目前对其发病 机制并不十分明了，运用蛋白质组学技术对疾病的蛋白表达谱进行全面分析为各种疾病的发生机制、 早期诊断、进展监测、治疗靶点的确定提供了重要依据‘卜3l，随着蛋白组学研究迅速发展，已鉴定出许 多具有诊断和治疗作用的蛋白分子标靶。本研究首次应用蛋白质组学技术研究痉挛基底动脉及正常 基底动脉差异表达蛋白，以期为CVS发病机制研究、治疗的分子靶点等提供线索。 材料与方法 一、材料 1．标本：新西兰大白兔由南昌大学医学院动物科学部提供，所有实验流程均遵照中华人民共和国 科学技术委员会制定的实验动物管理条例。体重2．5～3．5kg的雄性新西兰大白兔共24只，随机分为 2组：脑血管痉挛组和正常对照组各12例再分别随机分为i份，每份4只，即实验组(T1，他，乃)和对 型成功建立，标本取自蛛网膜下腔二次出血后3天的痉挛基底动脉。 2．试剂：D1-I、SDS、CHAPS、IPGbufier、TRIS、ACRYLAMIDE 津福宇，裂解液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、20mMTris—HC pH7．4)、再水化液(7M尿素、2M硫脲、 20mM pH7．4)、液氮、TCA、BCA定量试剂盒、玻璃珠(0．4～0．6mm)、研磨沙等。 3．仪器：离心机、双向电泳：GE six、双向电泳分析软件imagemaster5．0、摇床、A4投射扫描仪，细胞超声破碎仪、超声清洗仪、低温高速 离心机、核酸蛋白定量仪、研钵、震荡混合器、低温及超低温冰箱、组织匀浆器、细胞刮、质谱仪为 ABl4800 MALDI—TOF／TOF等。 二、方法 1．蛛网膜下腔二次出血模型的建立：实验采用兔的二次蛛网膜下腔出血模型[4]。第0天，戊巴比 缓慢注血，时间不少于3分钟；24小时后重复此操作，正常对照组同样进行穿刺但不注血。 2．DSA检测脑血管痉挛以及形态学观察：麻醉后，各组的动物分别在注血前(第0天)及第二次注 血后第3天行脑血管造影。经股动脉插入5一F导管至左侧椎动脉，在相同放大率下注入OMNIPAQUE version 2ml后行脑血管造影。基底动脉的直径通过计算机影像分析系统(NIHImage 1．62)进行测量， 每个基底动脉图像取三个测量点：两侧椎动脉汇合点上方0．1mm处，基底动脉中点以及基底动脉顶端 下方0．1mm处；三点测量的平均值作为基底动脉的直径值。将二次注血后第3天造影的测量结果与注 血前进行比较的百分比值作为最终统计数据。在二次注血第3天造影后行胸廓切开术，灌注固定，取 附有基底动脉的脑组织，切成4p,m厚薄片行HE染色。光镜下观察形态学变化，包括血管壁厚度、内弹 基金项目：国家自然科学基金资助项目 作者单位：361022厦门大学附属第一医院杏林院区神经外科 通信作者：洪涛 ·488- 力层皱褶及平滑肌细胞收缩等的变化。 3．组织标本的处理：采用兔耳沿静脉注入过量戊巴比妥钠使得兔处于深度麻醉，无菌条件下取出 moL／L 兔基底动脉迅速放人预冷的O．01 PBS液中漂洗干净，滤纸吸去多余的液体，处理后的样品立即 用于蛋白质的抽提或置于一80℃保存备用。 4．双向电泳、银染及质谱鉴定：(1)标本处理：处理方法根据液氮研磨及丙酮沉淀法进行处理，RC DC proteinAssay IYlT 缓冲液[7mol／L尿素，2mol／L硫脲，2％CHAPS，100mmol／L0．2％(W／V)IPGbufferPH4—7，痕量溴 酚兰]充分混合，上样总体积为450ul选用24cmIPG胶条。等电聚焦、平衡、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电 均凝胶，匹配、量化获取斑点的相关信息等分析。(5)质谱鉴定：脱色、还