抑制Pygo2表达对U251细胞增殖影响.pdfVIP

1细胞增殖的影响 抑制Py902表达对U25 陈玉莫 王海东 王占祥谭国伟 刘希尧 沈上杭 胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，临床疗效差，平均生存期短，目前仍没有一个 十分有效的基因治疗靶点。Py902对于恶性肿瘤细胞的生长是必不可少的…，已有研究表明Py902与 wnt信号及多种恶性肿瘤发生密切相关‘2|。本课题前期研究发现Py902在脑胶质瘤组织细胞中高表 达，并随肿瘤恶性程度增高而增高，可能是脑胶质瘤基因治疗的新的重要靶点。故本研究构建了针对 的作用。 材料和方法 eoli感 1．材料：(1)细胞株、质粒及菌株：脑胶质瘤细胞系U251购于上海细胞研究所，Eseheriehia 受态菌株DH，仅(厦门大学生命科学院冻存)，质粒pSuperbasie由厦门大学生科院李博安教授惠赠。 Cruz公司，增强化学发光试剂盒ECL购于Pierce公 (2)主要试剂和仪器：Py902多克隆抗体购于Santa ITCBrdUFlow 司，PI为Sigma公司产品。F Ladder、脂质体转染 Kit试剂盒为BD公司产品，2000bpDNA I、Sgl lI、Hind m、T4DNA连接酶、Syber—green 7 shRNA：正 向 序 列： 5 一 TGAATTTCTGACAAGAGGCCTCACAGGG一3’；随机对照8crshRNA：正向序列：5’一 BLAST软件，对选定的靶序列进行同源分析，排除非特异性抑制其他基因片断的可能。序列由上海生 II在37cC顺序酶切、纯化，将上述载体和双链寡核苷酸用T。DNA连接酶连接后，转化大肠埃希 和Bgl PCR产物已经插入质粒载体，并上海生工生物公司进行DNA序列测定。(3)胶质瘤U251细胞转染： h后按 (1—2)×105／：fL接种于装有盖玻片的六孔细胞培养板中，使细胞的日融合率为80％～90％，24 shRNA、Py902shRNA、空白(仅脂质体)，具体操作按照 每孔0．8¨g质彬2．4“l脂质体分别转染$cr Limpofectin2000转染试剂盒说明进行。培养48h用于后续实验，细胞即分成了三种(组)：control组、 $cr shRNA组。(4)半定量RT—PCR：转染后48h收获细胞，Trizol法提取总RNA，利 shRNA组、Py902 bp。 作者单位：361003厦门大学附属第一医院；厦门市神经系统疾病诊治中心；重庆邮电大学生物信息学院生物技术教学部 生厘区垣怂金挫经丛拄匿垣筮金二二筮盔屋全国岱蠢左金迨塞垂缉 GAPDH 一ACCACAGTCCATGCCATCAC 一 内参 上游引物：5’ 一3’，下游引物：5’ TCCACCACCCTGTTGCTGTA一3’，片段长度450bp。PCR反应体系为25山，其中，l×PCR缓冲液， 0．2mM U dNTP混合物，cDNA模板，100 pmol特异上、下游引物，2．5TaqDNA聚合酶。PCR扩增反应 blot：转染48 相对系数表示。(5)Western h后分别收集每组细胞提取总蛋白。取总