人端粒酶hTERT单克隆抗体制备和鉴定及在肿瘤检测中的应用.pdfVIP

中国癌症研究进展@ 人端粒酶hTERT单克隆抗体制备与 鉴定及在肿瘤检测中的应用 张渡杨邵教王俊梅韩继生卫建平侯琳昊秉铨 端粒酶通过催化端粒合成，保持其长度而维持细胞的分裂能力。因此，端粒酶的正常活性 是生殖细胞、干细胞保持增殖能力的基础，而异常活化则是癌细胞无限增殖的关键…。端粒酶 活性检测或抑制成为肿瘤诊断和治疗的新靶点“】。端粒酶由蛋白质催化亚基和指导端粒合成 的RNA模板组成，即为具逆转录酶特性的核糖核蛋白酶”J。研究表明：人端粒酶蛋白亚基基 端粒酶的活性，抑制癌细胞的生长；而hTERT的导人可使正常细胞端粒酶阳性而细胞寿命延 长“1。近年来本研究室及国外研究观察证明：人肿瘤组织中hTERTmRNA水平与癌细胞端粒 酶活性一致”01。因此，特异抗体的开发检测hTERT蛋白表达在肿瘤诊断中具有重要的意义。 了鉴定和肿瘤研究的初步应用。 材料和方法 (一)动物及细胞培养 BALB／c小鼠购自北京大学医学部动物中心。$P2／0小鼠骨髓瘤细胞系由本校免疫学系邓 鸿业教授惠赠，于含10％热灭活小牛血清的RPMI1640培养基中培养。HeLa细胞：人宫颈癌 粒酶阳性，购自中科院上海细胞生物所。2BS细胞：人胚肺二倍体细胞，端粒酶阴性，购自天坛 养基。于”℃，5％c02恒温箱(NAPCO，美国)培养。 (二)主要试剂 RPMI mouse 佐剂为Gibco monoclonal BRL公司产品；PEG4000、降植烷，ImmunoTypeTMarItiboayisotyping B|ueRangerTM 关试剂为ACT公司产品。 (三)们圈盯抗原多肽的合成 作者单位；100083北京．北京大学医学部病理学系 人端粒酶hrEI玎单克隆抗体锅备与鉴定及在肿瘤检测中的应用295 Model 产物经HPLC和MALDI—TOF—MS质潜检测。 (四)半抗原与载体的偶联”1 ml0．1mol／L磷酸盐缓冲液中 hTERT9，hTERT7与BSA或OVA以摩尔比5：1混合，溶于2 ml21 7．o)，逐滴加入1 mnml／L戊二醛，并不断搅拌，室温反应24h；于0．1 (pH mol／L磷酸盐缓 冲液中透析过夜，更换透析液继续透析4h，4℃保存。 (五)细胞融合及杂交瘤制备 d后将已免疫小鼠的脾细 注射480腭hTERT9，hIY．．．RT7一BSA抗原(含hTERT9，hTERT,40滗，3 d半量换液1次，HAT液培养2 滴人已铺有饲养细胞的96孔培养板内，5％c晚孵箱培养。每3 出100FJl．qA法检测抗体分泌。阳性克隆经有限稀释法进行3次亚克隆。 t-d 周以上BALB／c小鼠腹腔内，每只小鼠注射1×1旷杂交瘤细胞。两周后收取腹水。腹水经 pH7．4的饱和硫酸铵沉淀法初步纯化”J，纯化后用Bradford法…测定蛋白浓度为9Ⅱ卅Ⅱd。 (六)Ⅱ腮A法 2 照为Sp2／0细胞培养上清，370C孵育1．5—2 兔抗小鼠Ig，37℃孵育1．5 于阴性对照2倍以上即为阳性克隆。 (1：300)混合，加入封闭后酶标板孵育，其余同上。 ， 400)，14P．P 马、hTERT，一OVA包被酶标板，然后逐步加入不同稀释度的单克隆抗体(1：2∞～1：6 标记的兔抗小鼠k，OPD底物液显色。以抗体浓度的对数