猪白细胞介素-6基因的非融合原核表达的研究.pdfVIP

猪白细胞介素一6基因的非融合 原核表达研究i 林海波，张桂红“，詹园英，廖明，任涛，罗开健，曹伟胜，徐成刚。辛朝安 广州华南农业大学兽医学院，广0+1，广东，510642 了离效表达，表达量约占总蛋白的25％。表达的蛋白以包涵体形式存在，包涵体经过变性溶解和复性后用酶联免疫吸 附试验(ELISA)做定性定量检测。ELISA结果证实了所表达出的蛋白为猪lL。一6，复性后具有一定活性，并测出了复性 后活性蛋白的浓度。 关键词：猪；白细胞介素一6基因；非融合原核表达；SDS—PAGE；ELISA 白细胞介素(IL一6)是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，它司‘以促进多种细胞的增殖和 分化。IL一6参与了整个免疫体系的反应，包括体液免疫与细胞免疫，其免疫调节作用促使人们将目 光投向了IL一6的新型疫苗佐剂应用研究。至今为止，猪脾细胞来源、成纤维细胞来源和外周血尊核 细胞(PMBV)来源的lL一6基因克隆都已取得成功u’23J。虽然猪IL一6鼠可由多种淋巴类和非淋巴 类细胞产生，但是从组织细胞提取IL一6的量甚微，无法满足研究与应用的需要。近年来国内开始r 对猪IL一6蛋白表达的研究。使用基因工程技术可使克隆的猪II。一6基因在细胞中直接高效表达，从 而获得可观的蛋白量。本研究基于已研究报道H5o猪IL一6基因在大肠杆菌中表达出的融合蛋白具 有一定生物活性，构建离效表达猪IL一6的非融合原核载体，并进行诱导表达及表达产物的复性研究 为新型免疫增强剂的研制、开发与应用奠定基础。 1材料和方法 1．1 材料 重组质粒pMDpIL一6由本室构建并保存；大肠杆菌DH5a感受态细胞由本室保存。，豚核表达载 体pBV220由华南农业大学微生物教研室黄青云教授惠赠。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标 准蛋白质(购自华美生物工程公司)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自上海朗卡生物技术有限 I、salI)、T4DNA连接酶均为大连宝生物1：程有限 公司)。DNA聚合酶(Taq)、限制性内切酶(Et：oR 公司产品。 1．2方法 1．2．1 引物设计与合成 按所获得的猪IL一6cDNA全序列中编码IL一6蛋白的DNA序列，设计 TGA换成TAA终止密码子。引物由上海申友生物技术有限公司合成，序列分别如下：-}：游引物 *本课题获得华南农业大学校长基金资助。 **通讯作者：张桂红，博。j：，剐教授，Email：guihongzh@8CaD．edu．cn。 兽医部分 671 ’l’ATCCGAATGG～3’。 1．2．2猪lL一6基因的获得 进行EcoRI、SalI双酶切并纯化。 1．2．3 1．2．4阳性表达菌的筛选与鉴定从上述过夜培养的平板中挑取单个白色菌落，接种于5m1含AⅡ·D 的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，分别用PCR和酶切反应进行鉴定。选择经质粒酶f；!：)和质粒 的基因均从正反两个方向各测一遍，从而确定阳性表达菌株。 —PAGE初步鉴定。 1．2．6蛋自表达方式的确定 养基，再用10ml X n．1 达蛋白是以呵溶形式还是以包涵体形式存在。 积的生理盐水4℃搅拌进行透析复性，每2h换液一次，经换液6次。所获蛋白质溶液过滤除菌后于 4℃保存待用。 1．2。8ELISA方法对表达蛋白的定性及其复性效果检测使用的试剂盒为双抗夹心ELISA法。具 3～5为稀释法包涵体复性蛋白(分别稀释2、 照，孔2为阳性对照(猪IL一6蛋白浓度为175pg／m1)，孑L Anti II。一6Biotin和 3、4倍)，孔6。8为透析法包涵体复性蛋白(6h、8h、24h)。②每孔加入40111pig 40ulAnti II．一6 pig 涤液洗涤反