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第二部分新型酶制剂及其应用
一种基因工程菌代谢丙酮酸能力的检测方法
及在酶工程中的应用
王成华1蒙建宗2杜奇石2韦航2李晓明1
1南宁邦尔克生物技术有限责任公司 广西南宁530003
2广西大学生命科学与技术学院广西 南宁530004
【摘要】丙酮酸是生物体内物质代谢的枢纽,与之相关的酶及代谢途径成为现代基因工程,特别是代谢工程研究的
关键,建立简便而有效的检测方法成为丙酮酸代谢相关工程茵研究的前提。本研究基于丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生
羰基化反应的原理,建立了优化的丙酮酸检测体系;在研究了常见物质对所建检测体系的影响的基础上,将之推广到发
酵产物体系的检测中;利用含有丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程茵,进一步验证了检测方法的可行性。
【关键词】丙酮酸 2,4一二硝基苯肼 基因工程茵 丙酮酸甲酸裂解酶
随着化石资源的日益枯竭和环境污染问题的
日益加剧,以微生物或酶为生物催化剂完成的生 蛐恤r叩韭蜴鼬
物催化为核心的工业生物技术,作为工业可持续
发展最有希望的技术得到了长足的发展。特别是
伴随着现代分子生物学技术进步和后基因组时代 岬刊R~㈣一
的到来,现代酶制剂的研究开发充分借助于分子
酶工程对酶本身的特性进行改造,借助于代谢工 图1大肠杆菌中丙酮酸相关代谢途径
程对制备酶制剂的宿主菌进行设计,以从质和量 ldhA:lacticacid
dehydrogermse:
oxidaseB:
上根本性提升现代酶制剂工业。 PoxB:pyruvate
丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物,可通过 PDH:Pyruvatedehydrogenase:
乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨 Pfl:Pyruvateformate—lyase.
基酸间的互相转化,成为三大营养物质代谢联系
从丙酮酸量的变化或相关酶活的测定出发,
的枢纽。丙酮酸代谢能力的高低对引导所构建的
建立简便而高效的检测丙酮酸代谢能力的方法,
代谢工程菌代谢流的流动,提高物质与能量转移
是丙酮酸代谢相关酶酶制剂研发和相关代谢工程
的效率和积累目的代谢产物具有核心的决定作
菌株构建的前提。目前,已经建立的丙酮酸检测
用。借助于分子定向进化技术或代谢工程技术,
方法主要有以下几种:高效液相色谱法,酶耦联
对生物体内与丙酮酸代谢相关的酶及代谢途径进
法,紫外一可见分光光度法等。然而,试剂价格或
行优化设计是达到提高丙酮酸代谢能力的理想手
者特殊设备的要求限制了上述实验方法的普遍开
段。例如,大肠杆菌中丙酮酸代谢相关酶与代谢
展,有必要建立一种简便而又有效的检测工程菌
途径如图l,在大肠杆菌基因工程菌的构建中,为
中丙酮酸代谢能力的方法。
了引导丙酮酸的代谢流,常针对PDH、LdhA、PoxB
本研究基于2,4
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