玉米大斑病菌PKC基因反义表达载体构建.pdfVIP

第一届令国玉米有害生物控制技术学术研讨会 论文摘要集 玉米大斑病菌PKC基因反义表达载体的构建 赵巍，王青，郝志敏，韩建民，董金皋 (河北农业大学植物分子病理学实验室，河北保定071001) 玉米大斑病菌是引起玉米大斑病的病原真菌，该病害对玉米产量及品质造成 严重的影响。玉米大斑病菌从孢子的萌发、附着胞形成及成熟到侵入寄主体内是 一个复杂的过程，可通过不同的信号转导途径来调控。研究表明，Ca2+信号转 导途径对桃褐腐病菌(Monilinia 一族磷脂依赖的丝／苏氨酸激酶，由二酰甘油(DAG)、Ca2+等第二信使激活。研 究发现，PKC基因在真菌中具有重要的功能，如Oeser通过基因敲除的方法研究 了玉米小斑病菌的尸：配基因，他尝试了各种方法都没有得到该基因的敲除突变 体，推测PKC基因在玉米小斑病菌的代谢过程中起着关键的作用，被敲除很可 能引起致死突变。Dickman等在紫花苜蓿炭疽病病原菌中得到的PKC基因敲除 突变体不能形成附着胞、不侵入完整的寄主内部。但是，这种突变体可通过人工 伤口侵入寄主，形成典型的炭疽病病斑。本实验室已经克隆了玉米大斑病菌PKC 基因的全长，本研究将构建反义表达载体来研究该基因的功能。 以野生型玉米大斑病菌的RNA反转录得到的cDNA第一链为模板，根据 I)和PKC．DOWN PKC基因组cDNA序列设计一对引物PKC．UP(含酶切位点胁f (含酶切位点SacI)，用于扩增PKC基因部分cDNA序列。经PCR扩增产物 的凝胶回收及克隆测序正确后用于反义表达载体的构建。首先将经过SmaI酶切 的pS01载体与同样是平末端的PKC基因扩增产物连接，转入大肠杆菌挑取阳 性菌落。用PKC基因特异性引物检测，能扩增出大小约600 bp的条带，说明PKC 基因已经与pSOl载体连接成功并已转入大肠杆菌中。将这些阳性克隆提取质粒， I和风fI单酶切位点和PKC基 进行酶切验证。根据pS01质粒图谱中含有Sac 因片段中也含有这两个酶的单酶切位点，经SacI单酶切后两者进行连接，电泳 检测得到981 I单酶切后两者进行连接，电泳检测 bp和6311bp的条带；经Af 得到1079 bp和6213bp的条带，与预期相吻合，说明反义表达载体构建成功。 将大量提取这些阳性克隆的质粒，用于转化玉米大斑病菌的原生质体，并进一步 获得PKC基因的反义表达突变体，用于研究基因功能。 一7一