一种大熊猫亲子鉴定试剂盒研制.pdfVIP

．582· 第七部分 水生动物及其他 一种大熊猫亲子鉴定试剂盒的研制 沈富军L2‘，张志和3，侯蓉3，杨建东3，张亮4，张文平4，岳碧松4 (1．成都大熊猫繁育研究基地，I玛11l成都610081； 2．四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，四川成都610081； 3．四川农业大学，四川雅安625014；4．四川大学，四川成都610064) 引言 有的“多雄配一雌”的交配方式也会带来诸如亲子关系混乱、近亲繁殖等问题。应用遗传标记对大熊猫进行亲缘关 系鉴定、遗传评估和监测已成为大熊猫保护生物学研究的重要课题。本实验室与英国利物浦大学合作，采用Dy砌 磁珠富集技术，曾获得20个panda系列引物(沈富军等，2005)。这些研究为大熊猫的亲子鉴定和谱系管理奠定了 坚实的基础。但是。上述微卫星标记没有经过系统的群体遗传学检测和评估，质量参差不齐：许多微卫星标记具有 较高的突变率，还容易出现多重扩增、假扩增、零扩增等现象，给基因分型带来种种困难。为了提高亲子鉴定的准确 forForensic 性，迫切需要制备亲子鉴定试剂盒——参照国际法庭遗传学会(InternationalSociety Genetics，ISFG) DNA委员会的要求：制备清晰的大熊猫等位基因梯度标准物(Ladder)作为分型标准，用以纠正分型错误。 材料与方法 等位基因梯度标准物的制备依赖于数据库的规模和质量。本课题组用ABI310型遗传分析仪将2001-2009年 间获得的大熊猫微卫星数据进行重新分型检测。以127个高质量的血液DNA为模板，统一条件进行重复试验：若 分型结果与以前的数据记录一致，则予以保留。若有差异，重复试验3-7次；同时，按照已知谱系核对亲代与子代的 基因型。将多重扩增、错误扩增、难以优化的标记予以淘汰。从46个大熊猫微卫星标记中，筛选出11个质量较好的 标记。然后通过大规模克隆、测序，获得各基因座每个等位基因的一级结构，并制备成相应的质粒。按照ISFG等位 基因命名法则对这些等位基因进行甄别和命名。然后用ROX荧光标记的引物对这些质粒做PCR扩增，制备各基 因座的等位基因梯度标准物(Ladder)。最后以这些等位基因为分型标准，进行大熊猫微卫星分型实验以及相应的 亲子鉴定研究。 结果 度标准物11个。分型标准物与各基因座的等位基因之间存在明确的一一对应关系，可以非常准确地进行微卫星分 型。本试剂盒11个基因座联合的个体识别非排除概率为1．64E一9，同胞识别的非排除概率为O．0002373。 讨论 本试剂盒使用了大熊猫真实的等位基因作为分型标准物，可以更加准确地对圈养大熊猫种群进行亲子鉴定和 遗传监测，还可以为野外大熊猫的群体迁移、行为生态等方面的研究提供非常有用的分子标记。这对于珍稀物种的 保种计划的制定和实施，具有非常重要的理论和现实意义。等位基因的命名是按照ISFG等位基因命名法则进行 的，也为形成学术规范、易化各单位的交流奠定了基础。 关键词：大熊猫；微卫星标记；等位基因；分型 (CPF080003)资助。 ·通讯作者，E—mail：sheriff001@sina．eom。