猪TMOD4基因的克隆、组织表达谱、亚细胞定位以与启动子分析.pdfVIP

猪遗传育种 猪TMOD4基因的克隆、组织表达谱、亚细胞定位以及启动子分析 赵晓，莫德林，李安宁，陈卫权，张宗武，张之晟，肖书奇，覃丽梅，牛玉娜，陈瑶生’ 中山大学动物遗传工程实验室，广州510006 关键词：猪：TMOD4；背肌；启动子分析 引言 TMOD基因家族是一类编码加帽蛋白的基因，在原肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用中发挥了重要的作用， 它特异的结合于肌动蛋白丝的慢速生长末端，阻抑肌动蛋白丝的伸长或者解聚，维持肌动蛋白丝的稳定。小 鼠中的研究表明超表达或抑制TMODl的表达会造成心肌功能的异常，转基因小鼠实验发现超表达TMODI 会造成小鼠胚胎的发育异常，另外有研究显示TMOD影响肌肉的分化过程。本研究的猪TMOD4足在猪的肌 肉组织中特异表达的，有可能与肌肉的生长发育有着重要的联系，然而有关于这个基因的报道却很少，在猪 中还未有研究。 材料方法 公司的SMARTTM 组织表达谱进行了研究，组织样本采自成年蓝塘公猪的心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌、后肌、 然后将重组质粒转染PKl5细胞，细胞在转染30小时后进行固定、染色，共聚焦显微镜观察、拍照。为寻找 然后将重组质粒转染C：C。：细胞，转染30小时后检测缺失片段的活性。核心区域确定后将该片段在转录因子 预测网站上预测，将预测得到的重要的相关转录因子突变掉，观察相应片段活性的变化。 结果 PCR扩增得到了包含猪TMOD4编码区的序列1227 bp，测序验证发现扩增得到的序列与拼接序列相比只 有一个碱基的差异，表明我们成功的得到了该基因的克隆。通过5-race实验，我们得到了TMOD4基因的5’ 末端序列，并确定了TMOD4基因的转录起始位点。组织表达谱的结果显示TMOD4基因在猪的肌肉组织中特 异表达，背肌中的表达量最高，后肌次之，除背膘组织中有微弱的表达外，在其他组织中几乎没有表达。TMOD4 基因亚细胞定位的结果表明该基因在细胞核内不表达，在细胞质内是广泛表达的。通过PCR扩增，我们得到 了～段长为2163 bp的启动子序列，通过逐段缺失的方法确定了启动子核心区域为转录起始位点前．233bp至 ．178 bp之间，与启动子片段一233bp相比，片段一178bp的活性有显著的降低。通过生物信息学的预测，我们 发现Cad这个转录因子可能对启动子的活性有重要影响。 讨论与结论 本研究首次克隆到了猪TMOD4基因，生物信息学分析发现该基因在猪、人、小鼠之间有很高的同源性， 人与小鼠中的研究已经揭示了TMOD家族的重要性。组织表达谱的结果说明该基因在肌肉组织中特异表达， 预示着该基因有可能在维持肌肉的正常功能中发挥重要的作用，另外有研究显示TMOD基因在肌肉的分化过 程中发挥重要的作用，因此对于该基因的深入研究对于探讨肌肉的分化机制及其功能的调控具有重要的意义， 为了进一步研究该基因的调控机理，我们将该基因的启动子进行了初步的分析，找到了该启动子的核心活性 区域，并鉴定出一个可能具有重要调控功能的转录因子，这还需要其他的实验来验证。本研究初步揭示了该 基因的一些重要信息，为更深入的研究打下了基础。 致谢 一333—