新型毛细管固定化酶微反应器的制备与在黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选中的应用.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 D06新型毛细管固定化酶微反应器的制备及在 黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选中的应用 张礼春李向堂胡坤 叶芳贵赵书林乖 药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室， 广西师范大学化学化工学院，桂林541004 Oxidase，简称XOD)是体内嘌呤代谢过程中的一种很重要的酶， 黄嘌呤氧化酶(Xanthing 是尿酸生成的关键酶。XOD是含钼蛋白酶，主要生化作用是催化次黄嘌呤及黄嘌呤生成尿酸 同时产生大量的02和H202等活性氧。体内XOD活性异常增高是体液尿酸浓度过高而引发高 尿酸血症和通风的一个主要机制，因此，XOD是高尿酸血症和通风的良好治疗靶点。对其进 行抑制剂的筛选研究具有积极的现实意义。毛细管电泳不仅是一种强有力的分离工具，还是 研究酶反应的理想平台。本文利用二甲基双十八烷基溴化铵(CDAB)阳离子表面活性剂，对 酶和毛细管壁的吸附作用，制备新型毛细管固定化酶微反应器，并对XOD的酶活性及抑制动力 学进行了研究，同时对酶微反应器的重现性也进行了评估。最后将所发展的固定化酶微反应 器用于中药粗提液中XOD抑制剂的筛选。 1．试剂 黄嘌呤氧化酶(XanthineOxidase，美国Sigma公司，O．67U．ml。1)；黄嘌呤(Xanthine， 美国Sigma公司，98％)；尿酸(UricAcid，美国Sigma公司，99％)；二甲基双十八烷基溴化 98％)；硼砂(分析纯，广州化学试剂厂)。实验过程中所用化学试剂除特殊说明外，均为分析 纯。试验用水均为亚沸蒸馏水，实验所用的溶液均经过0．45 lam纤维膜过滤。 2．仪器及毛细管固定化酶微反应器的制备 本实验所使用的仪器为HP3D型高效毛细管电泳仪(美国Agilent公司)。 毛细管固定化酶微反应器的制备步骤为：(1)用50mbar*5 SCC压力进样，将O．1％(w／v) CDAB导入毛细管一端约O．5cm，通过静电作用对毛细管内壁进行部分正电涂层修饰，保留 10min后在毛细管出口端加压，用去离子水将多余的聚电解质溶液洗去。(2)以相同压力、 相同时间的进样方式在有正电涂层的毛细管一端导入浓度为0．8U·mLJ酶溶液，孵育15min， 使呈现负电性的酶与带正电的CDAB涂层发生自组装，未结合的酶用去离子水在毛细管出口 端加压冲洗出毛细管柱。(3)重复步骤(1)，再次导入相同长度的CDAB溶液区带，使其与 酶形成“CDAB-酶-CDAB”的三明治结构，从而实现酶在毛细管内的固定化：然后，重复步骤 (2)、(3)形成更为稳定的多层固定化酶微反应器；(4)在进行酶活测定时，底物溶液以20 mbarx2 s压力进样导入有酶微反应器的毛细管一端，需要注意在每次进样前毛细管进口端用 水清洗以防样品之间的污染。孵育5min后，于毛细管两端加上21kV的电压，对未反应的底 物和生成的产物进行分离。酶活性可用产物峰面积来表示。对于抑制剂的筛选，在底物溶液 中加入一定量的酶抑制剂或待筛选化合物，用上述同样的方法进样并测定，最终通过酶活即 产物峰面积的变化来判定待筛选化合物是否具有抑制酶活的作用。此外，一旦微反应器的酶 活性降低或失去活性，只需通过以下步骤便可将酶微反应器进行再生：用氯化钠溶液(1 mol·L叫)、盐酸溶液(O．1 mol。Lq)及氢氧化钠溶液(0．1 mol·L。1)分别冲洗毛细管10min，使 管内的固定化酶洗脱下来，再用与前面相同的酶微反应器制备方法便可实现酶微反应器的再 151 全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 生。 3．样品处理 n1L 取粉碎并经过干燥后的黄柏粉末2．5 80％(v／v)乙醇溶液，回流提取三次， g，用50 (每次2．0