猪圆环病毒2型ORF2基因的改造与在大肠杆菌中的高效可溶性表达.pdfVIP

猪的传染瞒一猪圆环病毒病 2．4 wesk哪Blot分析 挑选一个经sDs．队GE检测阳性的样品进行weskmBlm分析，抗PcV2抗体与转染到Nc膜上 1K血左右有一明显特异条带，表明rcap蛋白具有与抗Pcv2抗 的《ap蛋白可以反应，经显色后在24 体反应的免疫学活性(如图4)。 浔=藩裟： 鸶 ■—● 143ko 图4 l蛆蛋白的w％kmⅢm检测 注：1*白样8，2怔分子量蛋白MⅪ虹‘ 3讨论 只携带6个组氨酸配体，配体分子量小．因此不用进行蛋白酶切割配体处理。这不仅简化了操作过程， R太大降低了生产成本，便于大量生产。 基因工程表达的融合蛋白只有经纯化后才可应片j【“…，本研究采用尿素溶解、低浓度蛋白复性 液复性、PBs透析等方法对重组蛋白进行纯化，免去了过镍一铬金属鏊台剂亲和层析柱纯化蛋白的 步骤，结果得到了纯度选95％以上的纯化蛋白。 本研究所得到纯化Ic印蛋白经wes妇nMot杂交分析后表明得到的呦蛋白可与抗Pcv2抗体茇 生特异性反应，表明ca口蛋白具有好的免疫学活性。这说明本研究所采用的纯化方法除具有操作简单、 成本低廉、纯化效果好、易于规模化生产等优点外，得到的纯化融合蛋白具有好的生物学话性，这 便于以后融合蛋白的大量纯他和产业化生产．同时本研究也为进一步研究阻cap蛋白为包被抗原的间 接EusA诊断方法的建立奠定了好的基础。 ●膏文■(‘) 猪圆环病毒2型0RF2基因的改造及在大肠杆菌中的高效可溶性 表达 葛猛奈*龙·车*盏罗罐车微孛品it向1军 (湖南农Ⅱ女学动物Ⅸ学＆长沙4lOl28) 是进行Pcv2疫苗研究吼及免疫活性研究的首选。晟初农壳蛋白在杆状病毒表达系统中成功表达井用 于检测Pcv2特异性抗体”_2l。然而，ca口蛋白在病毒感染细胞中不存在翻译后修饰∞l，因此适宜用原 核表达系统进行研究。 但是在大肠杆菌中单独表达完整的Pcv2．0RF2基因存在一定的困难，远程有可能与ORF2基因5’ 端的棱内化信号肽序列中存在大量精氨酸的稀有密码子有关。通过与麦芽糖结合蚩白融合表达可达 第十三次学术研讨会会议论文集 到表达少量oRF2完整蛋白【32】。用含有一些额外的编码稀有tRNA基因的大肠杆菌中大肠杆菌成功的 表达了多组氨酸标记的Cap蛋白，但表达量也非常低【3】。只有删除核内化信号肽，ol疆2蛋白才能在 大肠杆菌中得到大量表达”’制。 尽管删除了核内化信号肽的蛋白保留有抗原特性，目前也没有资料表明核内化信号肽中含有抗 原表位，但是多种抗原表位分析软件均预测在Cap蛋白N端核内化信号肽的41个氨基酸中有2个信号 很强的潜在抗原表位(见图1)。所以，包含核内化信号肽的完整cap蛋白非常值得我们去研究。本研 究通过基因人工合成的方法，将PCV2一oRF2基冈经过密码子优化和基冈改造后实现了完整的C印蛋 该病毒亚单位疫苗、诊断抗原及其免疫学相关功能研究奠定了基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1质粒与菌株 达载体pET32a(+)为本实验室保存。 1．1．2试剂 I、SalI、T4 DNA 限制性内切酶EcoR DNA连接酶、dNTPs、I胛G、DL2000Marker均购自大 连宅生物T程有限公司；蛋白Marker、质粒提取及胶回收试剂盒购自北京大根生物有限公司；PCv2 标准阳性血清由本实验室保存；DAB显色试剂购自北京天为时代科技有限公司；Nc膜和HRP标记的 兔抗猪IgG抗体(编号A5670)购于s逸ma公司。 1．2引物设计 引物均由上海生工生物技术有限公司合成。根据人工合成的oRF2基因序列进行引物设计。 0RF28的上游引物PCVFp28：GCGAAl盯CATGCCTT GCGA—气TTcATGGG吖盯兀TrAArACTCGrnATC，