辅酶Ⅱ酶法再生体系和草生欧文氏菌休止细胞偶联合成2-酮基-L-古龙酸研究.pdfVIP

第二届全国发酵工程学术讨论会论文集 1998 辅酶II酶法再生体系与草生欧文氏菌休止细胞 偶联合成2一酮基_L一古龙酸的研究 吉爱国，高培基，黄庆生 (山东太擘微生铀技术田孪重点实验尘．济南 250100) ■量 本文根据蛔曹合虚2．酮基古龙醵(2-KLQ)的≈s-二一基蕾蕾糟馥(Z5．．DKO)途径．掇讨 丁麓奠Ⅱ冀法再生体系与覃生敢文氏曹休止细臆偶联台成2．KLG的方法．采用蓓曹奠·超声渡破璧、 硫酸铵沉淀、丑离心、茸进、色谱等技术从棒杆曹细胞中分离纯化丁乏s_DKa还砸奠．鼙括O．0271U／ml, 比活O．019Yd／n礓．蛋白．将提纯的2I孓】)xo还坂謦与葡冀糖脱氯酶偶嵌构成丁Coil爵法再生体系．并 进一步与草生啦文氏■辨^蛔胞斯固定化细胞偶联．合成了}KI．G．量高浓度Z77mg／m1．辅酶II再 生次数达238敬． 关t坷· 2．甯基古龙馥， 辅酶II再生．土5_二酮基葡萄糖酸垤原酶．葡曹慧脱氢醵 L．抗坏血酸 2．酮基一古龙馥(2-KLG)合成是vc生产中的主要工作和关et带-B．已发现细菌中以葡 萄糖或山裂糖为最初底物台成2-KLG的途径有六条I“．其中的2．5．二酮基—口葡萄糖酸(2．5． DKG)途径和人工构建的2一酮基古龙麓遮径在蘸学机制上是一致的．部是在葡暂塘脱氨酶、 葡萄糖酸脱氢酶和2-酮基一n葡萄糖酸脱氢酶的催化下。将葡萄糖经由葡萄糖藏和2．喇基葡 成2-KLo理论上最先进，实用中最经济简便．田内外部在积极研究的串联发酵法和基因工程 苗一步发醇法注都是基于这一酶学机制．串联授酵法目前存在许多技术问韪．如生产周期长。 第一步发酵的产钫25-DKG不稳定，需经化学法灭茸、低温存放等一系列操作，然后进入第二 级发酵，转化率很低．一步发酵法蕾外虽己申请专利，但转化率比串联发酵法还蔓低很多．这 两种方法距工业应用都还有较大距离”I． 根据2,5．DKG途径的酶作用机制，针对上述两种方法存在的技术赡艇．我们设计了包括 辅酶lI群法再生体系在内的2-KLG酶促合成方法。如图1所示． 葡麓糖 萄格酸—] 7弋葡 ATCC1626 NADP N^DPH 休止细胞 ＼＼ ／ ．j 2-KI,G—--一2．5一DKGR一2．5-DKG 朋，．辅麓n奠涪再生多冀体摹古成2-一‘-L一古龙豫反应机疆示意舶 G嗍：蕾一■戚氯酶： 2．5-UKGR：2．6■基一D-葡蕾■酸还原■ l 利用葡警糖脱氢酶(EC1．1．47)将葡葛糖转化为葡柏糖盐．翩时将NADP还厦为 NADPH．用草生欧文氏茁休止细胞多酶体系将葡萄糖酸转化为2．5-DKG．然后利用2．5-DKG 酶U循环再生和由葡瑚糖到2-I∽的生物合成系统． 吉爱国等： 辅酶Ⅱ酶法再生体系与草生欧文氏苗休止细胞偶联合成2一酮基一I。一古龙酸的研究 1丰才料和方法 1．1■悻和试村 剂均为试惴 1．2葡膏嘲时分析方法一髑澎” 用DN3还原蕾法敲标准曲线．取样品稀释液2ml。加入2mlDN8．煮沸10min．定客 至15m1．铡O D，∞光吸收值．在标准曲线上畜得稀释渣浓度．撮精嘲啪挪耕算晌殂醐中葡 萄瞎舍t I．3乏5—珥瞄的分析方澎”I： 在试管中加入1．Oml适当稀释的反应液。依次加入0．8ml caa2．o．85ml1．5N 1．34n吲ml N1-140H和0．6rnl4NHCl混匀-”℃水浴l，分钟．测量460hm披长的光吸收值． 1．●2-KI启分析方法t71 兰角瓶中·加入2mi1％淀粉指示剂·用O．IN琅液滴定至涫液出现兰色，30秒不退色为止． 记最确裱用it．在12-Vc标准曲线上奄出相应vc总t．推算出样品中2-KLG台t． 1．5葡■糖臆氢一一辑舅定l-J 0．1M