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第五章 分子生物学研究法 重组DNA技术发展史上的重大事件 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 Meselson和Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和mRNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 1964 Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965 Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。 1966 Nirenberg，Ochoa、Khorana、Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 Boyer，Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 Sanger与Maxam、Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 Palmiter和Brinster获得转基因小鼠；Spradling和Rubin得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1988 Watson出任“人类基因组计划”首席科学家 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb) 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 DNA提取方法 选材 真核生物基因组DNA非常庞大，含有大量重复序列，使分离相应靶基因很困难。 从不同的生物材料中提取DNA用于研究DNA分子在生命代谢中的作用，由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。 cDNA不含重复序列，通过特异探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基因。 微生物中，谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。 从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。低等生物，如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，，因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。 1、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把Pro除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响不同 DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度