基于PCR 技术的miRNA 定量检测方法.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：８８９３ ? 基于ＰＣＲ技术的ｍｉＲＮＡ定量检测方法 陈　新　曾长英　卢　诚　王文泉 （中国热带农业科学院热带生物技术研究所　海口　５７１１０１） 摘要　ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一类广泛存在于真核生物中，不编码蛋白质的短序列ＲＮＡ，它广泛参 与真核生物的生长发育、新陈代谢和应激反应等生命活动。但绝大多数ｍｉＲＮＡ的生物学功能还 不清楚，通过灵敏的定量检测方法，了解ｍｉＲＮＡ在不同组织部位的时空表达，是探究其功能的重 要环节。现着重介绍了２类７种基于ＰＣＲ技术的ｍｉＲＮＡ定量检测方法的基本原理和实验流程， 并分析了这些定量检测技术间的异同和适用范围。 关键词　ｍｉＲＮＡ　探针　荧光染料　定量ＰＣＲ 中图分类号　Ｑ７５ 　　ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一类广泛存在于真核生物 植物从原来的９科２４种增加到１１科２９种，增加的２ 中，不编码蛋白质的短序列ＲＮＡ，长度为２０～２４ｎｔ。成 科是大戟科（蓖麻）和芸香科（金钱橘、红橘、甜橙、三叶 熟ｍｉＲＮＡ的５′端为磷酸基团，３′端为羟基，它通过与靶 橘）。单子叶植物有水稻、甘蔗、高粱、小麦、玉米，物种 ｍＲＮＡ特异性的碱基互补配对，引起靶 ｍＲＮＡ的降解 数虽然没有增加，但 ｍｉＲＮＡ的数量增加了３１２个。尽 或者抑制其翻译，从而实现对靶基因转录后的调 管ｍｉＲＮＡ的数目得到迅猛增长，但绝大多数ｍｉＲＮＡ的 ［１４］ 控 。ｍｉＲＮＡｓ在控制植物发育、开花时序、新陈代谢 生物学功能研究尚显滞后，而ｍｉＲＮＡ生物学功能研究 ［５１０］ 和应激反应等方面起着重要作用 。除此之外，多数 的重要一环是探究ｍｉＲＮＡ在特定时期、特定组织及特 ｍｉＲＮＡ还具有高度保守性、时序性和组织特异性［１１１５］。 定环境的表达特性，进而实现ｍｉＲＮＡ对目标基因的调 　　自ｍｉＲＮＡ被发现以来，该领域的研究得到迅猛的 控。本文重点介绍ｍｉＲＮＡ定量检测的常用方法，并从 ① 发展。ｍｉＲＮＡ的数目从ｍｉＲｂａｓｅ数据库 ２００２年１２月 原理上剖析了各种方法的异同及优缺点，以便科研人 最初发布Ｒｅｌｅａｓｅ１．０版本的２１８个迅速增加到现在的 员根据具体的实验目的和要求，选择最为恰当且经济 接近１５０００个，目前已连续更新发布了２９个版本，在 有效的检测方法，开展针对ｍｉＲＮＡ的研究。 ２００５年４月和２００７年１２月为时间节点可将ｍｉＲＮＡ的 发展分为３个发展阶段，第一阶段ｍｉＲＮＡ数目增长缓 慢；第二阶段增长较快；第三阶段则为ｍｉＲＮＡ的快速增 长阶段，且增加相同ｍｉＲＮＡ数量所需的时间越来越短 （图 １）。２０１０年 ４月 ｍｉＲｂａｓｅ数 据 库 释 放 了 Ｒｅｌｅａｓｅ１５．０版本，公布了 １４１９７个 ｍｉＲＮＡ，这些 ｍｉＲＮＡ分布于１３３物种，比半年前公布的１４．０版本增 图１　ｍｉＲＮＡ数目增加趋势图 加了 １８个物种和４０２２个成熟 ｍｉＲＮＡ。其中植物 Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｒｅｎｄｓｏｆｍｉＲＮＡｅｎｔｒｉｅｓ ｍｉＲＮＡ有２５７０个，增加了６３６个。被子植物内双子叶 植物的ｍｉＲＮＡ有１３６３个，增加了３２４个，其中双子叶 　　成熟ｍｉＲＮＡ长度为２０～２４ｎｔ，与常规ＰＣＲ反应中 收稿日期：２０１００７１６　　修回日期：２０１００８１８ 的引物长度相近，但常规ＰＣＲ无法实现对ｍｉＲＮＡ的检 国家“９７３”计划资助项目（２０１０ＣＢ１２６６０１） 测，这是ｍｉＲＮＡ分析检测的一大挑战。经过多年的努 通讯作者，电子信箱：ｃｈｅｎｘ