ATRA诱导HL-60细胞产生多药耐药相关基因的筛选和克隆.pdfVIP

国际小儿肿瘤研讨会暨第四届全国小儿肿瘤学术会 2003．中国．重庆 ATRA诱导HL一60细胞产生多药耐药相关基因 的筛选与克隆 付劲蓉 (重庆医科大学儿童医院) 急性髓性细胞白血病占儿童急性白血病的20％，随着化疗方案的改进和实施，其预后得到 了极大地改观，约40％的患者经过化疗可获得长期无瘤生存。但是白血病细胞对化疗药物的 耐药尤其多药耐药现象的存在常常使化疗归于失败。从发育生物学的角度讲，急性髓性细胞白 血病的发生往往源自于髓系细胞发育过程中的分化受阻，细胞化疗实施的局限性促使了分化诱 导治疗和化疗在临床上的联合使用。全反式维甲酸(ATRA)是目前最广泛应用的一种分化诱 导剂。近年有研究报道，其可诱导某重化疗药物乃要的产生，但是ATRA是否可诱导多药耐药 的产生尚待定论。在本研究中，我们以急性髓性细胞白血病细胞系HL一60为研究对象，建立 分子机制。 材料与方法 一、材料 1．细胞：人急性髓性细胞白血病细胞系HL一60购自中国科学院上海细胞研究所，常规传 次。ATRA用乙醇溶解后配制成lmmoL／L的浓度，一20。C保存备用。 二、方法 1．HL一60／ATRA的诱导；采用我们所建立的小量、多次、渐进化疗药物诱导耐药细胞系的 ATRA的浓度1倍，如此反复，经过6个月终于建立一株在0．3mg／LATRA仍然维持原有增殖及 死亡不变的细胞系，命名为HL一60／ATRA。 及HL一60对ATRA、MMC、VCR、VP一16、ADM5种药物的药物敏感性，重复12孑L，所获Ic50值 行统计学分析。并计算耐药倍数(resistante 其中Ic∞为半数抑制浓度。 cDNAsubtraction RNA)Kit及PCR—SelectTMKits分离 TECH公司的OligotexmRNA(messenger FermentaslinsT／AeloneTMPCR Kit将其克隆到PUC57／T载体，经过蓝白斑筛选，挑选白色 product 菌落(阳性克隆)即获得HL一60／ATRA抑制消减杂交文库。 一67— 国际小儿肿瘤研讨会暨第四届全国小儿肿瘤学术会 2003．中国．重庆 4．基因芯片技术对抑制消减杂交文库进行筛选：将抑制消减杂交文库中的211个阳性克 隆经PCR扩增后，纯化产物，每个样品重复2点，并与一定量的植物基因(排除外源性污染)、管 Psys5500芯片点样仪以针点(pinprinting)的形式将每个克隆有序地点在氨基化修饰的载波片 经过不同严谨度的洗片，激光共聚焦扫描仪读取荧光信号，利用ImaGene软件包进行扫描信号 度，共制作4张芯片以利于信号综合分析。 5．差异表达基因克隆序列的测定： 12个克隆进行首批序列测定。由大连宝生物公司协助完成。所用测序引物为克隆载体 GGGTY AGTCA Trccc CGAC，由 pUC57／T多克隆位点上游通用引物序列M13—47即CGCCA PRISM 大连宝生物公司合成。测序反应试剂为ABI BigDyeⅢTerminatorCycleSequencingReady ReactionKitwith DNA PRISMTM AmpliTaqpolymerase(AppliedBiosysterms)，测序仪为ABI 377XLLDNA sequencer。 6．差异表达基因同源性分析：