RNA干扰及其在喉鳞癌研究中的应用.docVIP

RNA干扰及其在喉鳞癌研究中的应用 　　作者：谢治年,综述,姬长友,审校　　作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所耳鼻咽喉-头颈外科， 重庆 400042 　　【关键词】 喉鳞癌 　　RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指一种双链RNA(doublestranded RNA, dsRNA)分子在mRNA(messenger RNA)水平关闭相应序列基因的表达后，使其沉默或表达下调，从而达到抑制某种特定基因表达的目的，是一种序列特异性的转录后基因沉默[1]。RNA干扰主要通过双链RNA被核酸酶切成21～23个小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)，这种siRNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成RNA诊导的沉默复合体,由此复合体介导使与双链RNA同源序列的信使RNA被降解,抑制基因表达;使细胞表现出特定基因缺失的表型,这是一种基因水平的生物自保护,起防止有害病毒或DNA破坏基因的作用。 　　1 RNA干扰技术简介 　　1.1 发现 当第一次将转基因导入植物细胞时，人们发现转基因的表达常常受到抑制。1989年，Matzke等[2]报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草，可引起转基因表达发生沉默。1990年，Napoli等[3]发现在牵牛花细胞中导入花色素苷基因不仅沉默了其自身表达，同时内源性基因的表达也发生沉默。该现象当时被称为基因表达共抑制或同源性依赖的基因沉默。在相当长一段时间内，转基因沉默被认为是植物独有的现象[4]。1995年，Guo等[5]发现用反义RNA能阻断线虫(c.elegans)par1基因的表达,但作为对照的正义链RNA,也同样阻断了该基因的表达。1998年，Fire等[4]的实验为这个令人费解的现象提供了注解，证实用于制备单链RNA(ssRNA)的常规实验方案，导致少量双链RNA(dsRNA)的形成;在除去dsRNA以纯化ssRNA后，反义ssRNA则丧失了大部分干扰活性，而正义ssRNA则完全没有活性，相反，dsRNA是干扰效应的有效诱导物。Fire并首次将dsRNA注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强得多的基因沉默。双链RNA 能够以同源互补序列的mRNA 为靶目标降解特定的mRNA,这个特异性和选择性抑制靶基因表达的过程称为RNA干扰。 　　随后, RNAi 在植物、真菌、涡虫、线虫、斑马鱼、果蝇、酵母等许多生物中被发现。1999年，哺乳动物中也发现存在RNAi 现象。因此,人们断定RNAi 是一种广泛存在于生物界的古老现象。RNAi的发现掀起了dsRNA介导的基因沉默作用分子机制生物学功能研究的热潮。 　　1.2 机制 目前已初步阐明RNAi的机制[4,6]。外源性或内源性的dsRNA在细胞内与内切核酸酶(一种具有Rnase样活性的核酸酶)结合，小分子RNA被切割成21～23nt且带有3′端单链尾巴及磷酸化5′端的短链dsRNA，即siRNA片段;由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，即RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，RISC中的siRNA随后变成单链，该单链siRNA识别同源靶mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA;接着siRNA与mRNA在复合体中换位，内切核酸酶将mRNA切割成21～23nt的片段，离开的siRNA单链可能被降解，因为在体内检测的主要是反义siRNA;此后可出现两种情况：①siRNA继续延伸，产生的dsRNA再次进入RNAi途径;②带切口的mRNA被进一步降解，mRNA产生切口后，RISC复合体可能再进入循环，进行又一轮mRNA降解。因此，几个siRNA分子就可引起强烈的RNAi效应[7]。最近还有学者[8]提出，在RNAi途径中存在一个信号扩增的过程，siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp)的作用下大量扩增并转运出细胞，使RNAi扩散到整个机体并传代。 　　1.3 特征[1,8,10,11,12] ①高针对性。RNAi 是siRNA 介导的转录后水平的基因沉默,这种作用是针对靶向基因的外显子序列, 而对其启动子或内含子序列却没有效应，外源基因也能被转录,但不能正常积累mRNA;②高特异性。小干涉RNA除正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其他单个碱基改变就可能使RNAi失效,siRNA只高度特异地降解同源靶向mRNA, 并不影响其他基因mRNA表达;③高效率。siRNA 在比同源靶向基因mRNA 低几个数量级的浓度就可以抑制其表达,使目标基因表达降到极低水平甚至完全剔除;④ 高稳定性。