抗菌肽Shiva-1a基因真核表达载体的构建和序列分析.pdfVIP

胺嘧啶、氨苄青霉素、林可霉素、土霉素、青霉素、先锋霉素100％的菌株产生耐药性。对金霉素、呋喃妥 因耐药率达60．2％。结论 家畜家禽鸡、鸭、牛、猪、兔均不同程度地感染耶氏菌，其中以猪的检出率4．60％显著地高于其它家畜家 畜监管，防止人感染耶氏菌。 抗菌肽Shiva一1a基因真核表达载体的构建及序列分析 宫晓炜 郑福英 蔺国珍 曹小安 王光华 周继章。 才学鹏。 (中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃兰州730046) 抗菌肽是生物体与生俱来的抗病原微生物感 方面打下基础。 染的小分子多肽，在先天性免疫抗感染的过程中 1材料与方法 起着十分重要的作用[1]。天蚕素类(Cecropins)抗 菌肽是南单基因编码的、细胞核糖体翻译的碱性 1．1质粒、菌株和细胞 小分子蛋白，具有分子量小、热稳定性强、无免疫 性、水溶性好、抗菌谱广等特点。此外，Cecropins Vector购自大连宝生物工 验室保存；pMDl8一T 抗菌肽对耐药菌株有职显的抑制作用，仅作用于 程有限公司；plRES2一EGFPVector购自上海捷 原核细胞及发生病变的真核细胞，对正常宿主细 瑞生物工程有限公司。 胞无损伤，是生物体防御细菌、真菌、囊膜病毒等 1．2主要试剂和仪器 PstI和BamH 病原微生物感染的主要屏障[2q]，并可作为先天免 I限制性内切酶、T4DNA连 疫促进因子调节机体的免疫应答。Shivala是人 接酶、高保真DNA聚合酶、普通质粒提取试剂盒 工合成的一种Cecropins类的细胞裂解肽，Reed均购自大连宝生物工程有限公司；DNAmarker购 等[‘1报道抗菌肽Shivala对胞内寄生的布鲁氏菌 自北京全式金生物技术有限公司；CH0一K1细胞 有一定的杀伤作用。因此，抗菌肽有望研发成一 株由本实验室保存；细胞培养基F12K购自In- 种新抗菌制剂用于临床，解决目前抗生素所引起 的耐药和体内残留等问题。 一EGFP—Shivala QIAprep?spinMiniprep试剂 在本研究中，利用重叠延伸PCR技术获得 Cecropins抗菌肽Shivala的成熟肽片段，通过分 子克隆方法构建真核表达质粒，转染CH0一K1及测序由大连宝生物工程有限公司完成。 细胞，用荧光显微镜观察，并应用生物信息学软件 1．3 Shivala基因的合成及扩增 分析和预测其二级和三级结构，旨在为进一步研 根据GenBank中shivala的序列，人工合成 究抗菌肽活性、作用机理和抗病转基因动物培育 shiva 基金项目：转基IIj生物新品种培育辩技重大专项(2009ZX08008--010B) 作者简介：官晓炜(1982一)，女．甘肃兰州人．博士研究生． ·通讯作者。才学■．E--mail：cair49罾vip．163．corn；周继章：0931--842673．主要从事动物疫苗及分子免疫学研究。 E--mail：zhoujizhang@126．coin 第三届全国人畜共患病学术研讨舍 213 中引人上游酶切位点PstT．在R2rIi引人下游酶 I．6 切位点和BamH 1以及6×His的标签。 的转染 FlAA CTGCAGATGA(；ATCTA(’CATGC