人胎儿肝脏间充质干细胞的体外培养及生物学特性研究.pdfVIP

中国医药生物技术 2010 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2010, Vol. 5, No. 4 277 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.04.008 ·论著· 人胎儿肝脏间充质干细胞的体外培养 及生物学特性研究 毕薇薇，黄若洋，刘洋 【摘要】 1 材料与方法 目的 建立一种在体外分离、培养人胎儿肝脏来源的间充质 1.1 材料 干细胞（MSC ）的方法，并研究其生物学特性。 1.1.1 标本来源 人胎儿肝脏组织来源于四平市 方法 采用双酶消化法分离获取人胎儿肝脏 MSC 并进行 中心医院药物流产胎儿，胎龄 2 ~ 3 个月，母亲身 体外培养，待细胞达 80% 以上融合时传代，各传代细胞依 体健康（捐献者均签署知情同意书）。肝功能正常， 次记为 P1 ~ P10 代细胞，并于倒置相差显微镜下观察细胞 肝炎病毒标志物均为阴性。梅毒阴性，HIV 阴性。 形态。取 P3 、P7 、P10 代细胞，连续培养 7 d ，观察分析 1.1.2 主要试剂与仪器 α-MEM 培养液和优等 细胞生长曲线。取 P5 代细胞，采用流式细胞仪检测 MSC 胎牛血清（FBS ）购自美国 Hyclone 公司；胰蛋白 表面 CD34 、CD44、CD105、CD13、HLA-ABC 、HLA-DR 酶购自美国 Gibco 公司；II 型胶原酶购自美国 等抗原标志的表达。取 P4 代细胞，进行体外成骨细胞诱导 Sigma 公司；FITC 标记的小鼠抗人 CD34 、CD44、 培养后，采用碱性磷酸酶染色鉴定。冻存传代细胞，分别于 CD105、CD13、HLA-ABC 、HLA-DR 单抗购自法 2 、6 个月后复苏细胞，台盼蓝染色计数复苏后细胞存活率。 国 Immuntech 公司；细胞培养瓶购自美国 Corning 结果 原代细胞 3 d 贴壁，6 d 后开始快速增长并形成集 公司；371 型高温灭菌 CO2 培养箱购自美国 落，11 d 左右达 80% ~ 90% 融合，多呈纤维样；传代培养 Thermo 公司；程序降温盒购自美国 NALGENE 公 后细胞维持纤维样形态。传代细胞生长曲线具有共同特征： 司；CKX41 型倒置相差显微镜为日本 Olympus 公 潜伏期约 24 ~ 48 h ，对数增殖期约 3 ~ 4 d ，对数增殖期后 司产品。 第 5 ~ 6 天进入平台期。流式细胞仪检测显示，MSC 表面 1.2 方法 CD34、HLA-DR 呈阴性表达，CD44、CD105、CD13 呈阳 1.2.1 人胎儿肝脏 MSC 的分离与培养 无菌取 性表达，HLA-ABC 呈弱阳性表达。碱性磷酸酶染色显示， 出胎肝，用 PBS 冲洗数次，剪碎后用 0.25% 胰酶 诱导后细胞的细胞核染成均一的淡蓝色。冻存复苏后细胞存 消化后 4 ℃ 过夜。次日取出于 37 ℃ 继续消化 5 ~ 活率达 90% 以上，且与未冻存传代细胞相比具有相同的生 10 min，吸出细胞悬液，在剩余组织中加入 0.1% 的 长特性。 II 型胶原酶，37 ℃ 中和 10 min ，消化后组织用 200 目筛网过滤，获得的细胞悬液 270 × g 离心 结论 本研究成功地从人胎儿肝脏培养出 MSC ，为 MSC 5 min，细胞沉淀用 PBS 洗 2 次。将细胞沉淀置 应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源。 于含 10% 胎牛血清的 α