HDA检测中蜂囊状幼虫病毒.pdfVIP

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2017-08-12 发布于安徽
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HDA检测中蜂囊状幼虫病毒.pdf

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HDA检测中蜂囊状幼虫病毒马鸣潇李勇飞辽宁医学院实验动物中心，锦州 121001 [摘要]本研究参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列，针对其结构蛋白基因设计了2条特异性引物，建立了一种灵敏、特异、快速的CSBV依赖解旋酶的扩增Helicase-DependentAmplification(HDA)检测方法。提取感染CSBV 的囊状幼虫RNA，反转录为cDNA，以其为模板，通过反复实验，对CSBV的HDA方法进行优化，验证其特异性、敏感性和稳定性，并对37份临床样品同时进行症状诊断、电镜观察，RT-PCR检测和HDA检测。结果证明所建立的HDA方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性，以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板，最低可检出10pgDNA。与健康幼虫、 ABPV、CBPV、BQCV和DWV的cDNA均无交叉反应，对37份样品检测，结果RT-PCR和HDA均能检出6份CSBV阳性样本，但通过电镜观察只检测到4份CSBV阳性样本。整个扩增反应可在90分钟内完成，操作简单，为CSBV的现场快速检测提供更加简便的方法，满足基层检疫的需要。 [关键词]：中蜂囊状幼虫病毒；HDA；敏感性；特异性 Helicase-DependentAmplificationforrapiddetectionofchinesesacbroodvirus LiYong-fei1,3MaMing-xiao1SongYing-jin2 1.Departmentoflaboratoryanimalcenter,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,121001 2.AgricultureandBiologyEngineeringCollege,TianjinUnibersity,Tianfin300072 3.TianheHospitalinTianjin,Tianjin300050 Abstract:Referencetothestudypublishedinthechinesesacbroodvirus(CSBV)genesequences,twospecific primersweredesignedforthestructuralproteingenes,asensitive,specificandrapidCSBVdetectionmethodwases tablishedthatisHelicase-DependentAmplification(HDA).CSBVRNAextractedfromLarvasinfectedbyCSBVwas reverse-transcribedintocDNA,asatemplate,throughrepeatedexperiments,tooptimizetheCSBVHDAmethod andverifythespecificity,sensitivityandstability.37clinicalsamplesweredetectedrespectivelybyHDA,RT-PCR analysisandelectronmicroscopy,withtraditionaldetectionofsymptomsdiagnosis.TheresultsprovethattheHDA methodhasahighspecificity,sensitivityandstability.WhentherecombinantplasmidcontainingCSBVstructural proteingenewasasatemplate,thelowestdetectionlimitis10pgDNA,andwhenhealthylarvaeABPV,CBPV BQCVandDWVcDNAwereastemplate,notargetfragmentsappeared;whendetectedin37samples,theresults werelikethat,6CSBVpositivesamplescouldbedetectedbyRT-PCRandHDAof,butonly4CSBVpositivesam pie