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引物设计原理# u/ ` q! ~9 Y??n4 X* U引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载；同源性比较；引物设计筛选；要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。一般引物长度为15－30碱基，扩增片段长度为100－600碱基对。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段。 6 `1 W1 _/ ? P$ N# O　　在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。! @: t0 G! Y4 oPCR引物设计的优化原则- k9 U0 Q% U5 K细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。??M9 S ]4 M- c4 A7 |. ^ ~, E; S4 E s2 l9 F0 O, M% I9 h1. 引物长度:如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。 每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。5 G9 Y??x A8 P2 F7 x,2. 引物GC含量：GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热度。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。上下游引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，有效启动温度，一般高于Tm值5－10℃。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和 Tm值的协调非常关键。同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。3. 引物Tm：引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间。引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。1 |/ H8 k E2 h. _( Z- t Primer Length Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) Primer Length Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) 4 12 °C 22 66 °C 6 18 °C 24 72 °C 8 24 °C 26 78 °C 10 30 °C 28 84 °C 12 36 °C 30 90 °C 14 42 °C 32 96 °C 16 48 °C 34 102 °C 18 54 °C 36 108 °C 20