HIV-1整合酶3′端加工抑制剂筛选方法的建立与优化.pdfVIP

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2014Oct；30(10)：1469—73 ·1469 · 网络 出版时间：2014—9—413：18 网络 出版地址 ：http：／／www．cnki．net／kcms／doi／10．3969／j．issn．1001—1978．2014．10．029．html HIV-1整合酶3端加工抑制剂筛选方法的建立与优化 陆翠林 ，张 旋 ，詹金彪 ，杨柳萌l，郑永唐 (1．中国科学院昆明动物研究所，中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室，云南 昆明 650223； 2．中国科学院大学，北京 100039；3．浙江大学医学院生物化学系，浙江杭州 310058) doi：10．3969／j．issn．1001—1978．2014．10．029 目前用于整合酶3端加工抑制剂筛选的方法主要有：放射 自 文献标志码：A 文章编号：1001—1978(2014)10—1469—05 显影 、时间分辨荧光、荧光共振能量转移 等。放射 自显 中国图书分类号：R977．3；R978．7 影法存在放射性污染，时间分辨荧光则需要特殊检测仪器， 摘要：目的 建立与优化HIV-1整合酶3端加工抑制剂筛选 这二种方法都不易普及 ；荧光共振能量转移在液相环境中进 方法。方法 利用荧光共振能量转移原理建立筛选方法 ，用 行 ，能更好地模拟体内整合酶活性 ，检测仪器相对简单，同时 DNaseI切割底物 DNA确定底物检测波长，在该检测波长 保留了荧光检测技术灵敏度高的特点。 下 ，对缓冲液成分 、底物浓度、酶浓度、金属离子浓度等影响 本文采用荧光共振能量转移原理，利用文献报道 设计 整合酶活性的条件进行优化 ，并用阳性药物雷特格韦和杨梅 的3端加工底物，通过考察检测波长、缓冲液配方、整合酶和 黄素进行方法验证。结果 检测波长为495nm／525nm，使 底物浓度 、金属离子等因素，建立并优化整合酶3端加工活 用缓冲液 1、底物浓度 500nmol·L～，整合酶浓度 1txmol· 性检测方法 ，用阳性药物雷特格韦和杨梅黄素进行验证，采 L～，镁离子浓度 20mmol·L 时整合酶 3端加工活性最 用建立的方法检测了25个细胞水平具有抗HIV-1活性但靶 强。在此反应条件下雷特格韦和杨梅黄素能有效地抑制整 点不明确的化合物对整合酶3端加工的影响，筛选到2个具 合酶3端加工活性。用所建立的方法筛选到2个有较强抑 有较强抑制整合酶3端加工活性的抑制剂，为抗 HIV新化 制整合酶3端加工活性的抑制剂。结论 该文成功建立并 合物的后续研究奠定了一定的基础。 优化了HIV．1整合酶3端加工抑制剂筛选方法。 1 材料与方法 1．1 反应底物 DS．1：5一[FAM]一ACTGCTAGAGATrrr 关键词：HIV-1；整合酶；3端加工；荧光共振能量转移；影响 CCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT一[DABCYL]-3“由生 因素；优化；抑制剂 工生物工程 (上海)股份有限公司合成和修饰。 1．2 主要试剂和材料 4一羟乙基哌嗪乙磺酸 (4一(2-hydroxy— 人类免疫缺陷病病毒 1(humanimmunodeficiencyvirus ethy1)一1-piperazinylethanesulfonieacid，HEPES)、聚 乙二 醇 1，HIV·1)感染宿主细胞是一个复杂的过程，HIV·1整合酶 8000(polyethyleneglycol8000，PEG一8000)、氯化锰 (manga— 在其中发挥重要作用。整合酶通过3端加工(3processing， ne