AIV的NP基因DIG标记探针制备的研究.pdfVIP

全国农业生化与分子生物学会第八次学术研讨会论文集 本试验在研究CP7菌抗菌蛋白的过程中，在采用常用的蛋白分离方法检测并鉴定出其抗 G+、G‘菌的活性成分的基础上，用基因工程的方法证实了13-1，3-1，4一葡聚糖酶是该菌抗真 菌活性组分之一，为该菌的利用提供了理论依据，也为生物资源的开发利用提供了借鉴。 AIV的NP基因DIG标记探针制备的研究 刘桂林1王娟1薄清如2 (1山西农业大学动物科技学院，太谷030801 2珠海市出入境检验检疫局检验检疫中心珠海519000) l前言 influenza 禽流感病毒(Avian 毒中同源性较高，保守性强，核蛋白具有型特异性，是流感病毒划分为A、B、C型的主要 依据。核蛋白是一种多功能KNA结合蛋白，在病毒复制过程中，在细胞中出现时间较其他 结构蛋白早，又是细胞免疫的靶抗原，可诱导机体产生细胞毒性T淋巴细胞反应【l弓】，因此 建立以NP蛋白为诊断目标的检测方法可检测各种亚型的禽流感，对禽流感的早期诊断具有 重要意义。核苷酸分子标记杂交探针技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技 术之一，是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具，酶联免疫吸附法、RRT．PCR 检测病毒、RT-PCR．酶联免疫吸附法、各种核酸分子杂交技术及基因芯片技术为基础的检 测技术等都应用了探针技术。为从分子水平探讨越的发病机理和临床早期快速诊断提供新 的研究手段㈣。本实验从GeneBank下载禽流感病毒NP基因序列，通过比对选取NP基因 中较为保守的片断，设计一对引物，通过RT-PCR方法扩增目的片段，用分子克隆方法构建 重组质粒，测序后将本研究设计的引物扩增序列与AIV各亚型NP基因进行同源性比较，根 据同源性大小来判断利用地高辛标记扩增产物制备探针。为禽流感病毒感染禽类动物提供一 定的致病机理研究，也为以后预防和治疗该疾病奠定一定的理论基础。 2材料与方法 异性引物(上海英骏生物有限公司合成)，用RT-PCR获取相应的cDNA基因序列，作为检 测各种亚型禽流感的探针。PCR产物克隆到pGEM．TEasyvector进行测序(由上海生工公 司测定)。将测序得到的结果在NCBI上与多株禽流感病毒NP基因进行同源性比较，确定 同源性的大小；利用Roche公司提供的DIG标记对照DNA，检测探针的浓度；将基因重组 质粒稀释成不同的浓度，变性后点样于正电荷尼龙膜上，用探针杂交显色，检测DIG标记 病毒的核酸进行杂交，检测探针的特异性。通过上面三方甄的检测，从而制备一条敏感特异 的DIG标记探针。 3结果与分析 利用特异性引物P15’AAGCGGAGG。¨ACACCAAC3’P25’ATGTCAAAG GAAaXACGAT 对照的片段大小相符。 经RT-PCR扩增获取相应的cDNA基因序列(NP基因片段)测序结果如下： 全国农业生化与分子生物学会第八次学术研讨会论文集 Ae}(jAA觚ACTGAGCKxAGAACGTCTGACATGAGGACTGAAATCATAAC}AATGiATGGAA GAAAAC；GCAACGAACCCG√^=rCGTG(：C’11CC?I’ITGACJ、T 将测序得到的结果在NCBI上进行比较分析．发现测序结果与GenBank中注册的多株禽 流感病毒NP基因的同源性在92％以上。与Genbank中编码为￡YQ2墨2Q兰：!的毒株同源性可 达99％。利用Roche公司提供的DIG标记测序的DNA即得DIG标记探针，将探针做不同 的稀释后点样子正电荷尼龙膜上，检测显示探针的浓度约为l叫皿。将基因重组质粒稀释 成不同的浓度，变性后点样子正电荷尼龙膜上，用探针杂交显色。探针可以检测出约1p∥皿 EDS．76病毒的核酸杂交结果为阴性。结果表明：本试验对AIV的NP基因RT-PCR扩增的 270bp片段可以制备成一条特异性敏感的探针。该研究制备的特异性敏感探针将为下一步试 验建立一套检测NP基因的原位RT-PCR方法做好基础。 4结论 ．通过计算软件设计一对AIV NP基因的特异性引物，扩增出270bp的片段，可检测出禽 流感病毒，具有禽流感群特异性；．成功构建本研究所设计探针的重组质粒，测序结果与 C．m国ank中注册的多株禽流感病毒基因的同源性在92％以上；．研制了一条敏感