东北刺人参RAPD反应体系的优化.pdfVIP

维普资讯 第 3O卷 第 1期 延 边 大 学 农 学 学 报 Vo1．3ONO．1 2008年 3月 JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversity M ar．2008 东北刺人参 RAPD反应体系的优化 高 日， 廉美兰 ， 吴松权 ， 朴炫春H ， 林长春 (1．延边大学农学院，吉林 龙井 133400；2．延吉市林业局 吉林 延吉 133000) 摘要：以东北刺人参试管苗叶片为材料 ，建立东北刺人参 RAPD反应优化体系．结果表明： 20．0 L反应体系含 250．0~／mol／LdNTP，2．0／~mol／LMgC12，l×Buffer，0．3x／mol／L引物， 10．0ngDNA模板，1．5UTaqDNA聚合酶 ，9．8 LddH2O；扩增反应程序为：94℃预变性 5 rain，94℃变性45S，36℃退火 1min，72℃延伸 1．5rain，4O个循环 ，最后 72℃延伸 7rain时 获得的 RAPD指纹图谱带型清晰、重复性好． 关键词 ：东北刺人参；RAPD；优化 中图分类号 ：$567．5 3 文献标识码：A 文章编号 ：1004—7999(2008)01—0001--04 东北刺人参(OplpanaxelatusNakai)系五加科刺人参属多年生落叶灌木 ，又名北五 加 、刺参，分布区域十分狭窄，全世界只在中国、俄罗斯、朝鲜 3国境 内有少量分布，在我国主 产于吉林省长 白山海拔 700~2000m 的针叶林带及辽宁东部 山区海拔 800 1000m 的松 杉林下[】]．近几年由于人为采挖 ，自然资源遭到严重破坏 ，经调查整个长 白山区小片生长 的 天然东北刺人参 已屈指可数[2]，对东北刺人参的保护追在眉睫． 近几年来，国内对东北刺人参的致濒因素和保护对策也进行了一些探讨[3]，但 尚未见 有关东北刺人参遗传多样性的研究报道．本试验对东北刺人参基 因组 DNA提取方法及其 RAPD扩增条件进行了优化，以期建立适于东北刺人参的简单、高效、稳定的RAPD反应体 系，为其种质资源和遗传关系等方面的研究提供依据． 1 材料与方法 1．1 材料 将东北刺人参茎端消毒 ，接种在MS培养基上 ，取培养 3Od后生长健壮 的试管苗 l0瓶． 1．2 方法 1．2．1 基 因组 DNA 的提取 DNA提取采用CTAB法[引：1)取东北刺人参试管苗，称取 0．2～O．3g叶片放在预冷 的研钵中加液氮研成粉末 ，迅速装入 1．5mL离心管中，加入 1mL65℃预热的CTAB缓冲 液 ，再加入 200 L的 l3一巯基 乙醇 ；2)放在 65℃水浴锅 中温浴 0．5～1h；3)取 出，待其冷 却至室温后加入等体积氯仿和异戊醇 (24：1)，8000r／min离心 15min，抽取上清液；4)重 复 3)步骤 1次；5)在上清液 中加入 2／3体积冰冷的异丙醇 ，放入一20℃冰箱 中3Orain；6) 从冰箱中取出离心管，用移液枪挑 出 DNA，转入 1．5mL小离心管中，用 70 乙醇漂洗 3 收稿 日期 ：2007—10—18 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目． 作者简介：高 日(1982一)，男．吉林抚松人 ，延边大学农学院园艺系，在读硕士．朴炫春为通讯作者 ， Tel：0433—3263389，E—mail：nyypxc@ybu．edu．cn． 维普资讯 延 边 大 学 农 学 学 报 第 3O卷 次，自然晾干 DNA；7)当沉淀无 乙醇气味时加入 1×TE缓冲液 5O L，溶解 DNA；8)离心 管中分别加入 2 “L的 RNase， 7乙水浴 锅 中温浴 2h，5000r／min离 心2min，取 5 ~LDNA溶液 ，在 0．7 的琼脂糖上 电泳 ，检测 DNA浓度及纯度．检测后 的DNA在 4℃下 待