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荧光定量PCR 技术  常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对 PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量， 如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧 光定量PCR 技术便应运而生。 1、荧光定量PCR 概念 所谓定量PCR 技术（real-time PCR），是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（如下图）。  2、荧光定量PCR 与普通PCR 的主要区别 理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。 这是因为随着PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq 酶都被饱和以后， PCR 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平 台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96 次PCR 重复实验，各种条件基本一致，所得 结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR 产物的量直接计算出起始DNA 拷 贝数。  而从上图我们也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行96 次扩增，终点处检测产物量不恒定， 但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR 技术的应用提供了 理论基础。 3、几个基本概念 为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR 技术，接下来有必要向大家介绍几个最基本的概念。 3.1 扩增曲线 为了更好的理解荧光定量PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR 动态进程的曲线即扩增 曲线。前面我们也了解到，PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S 型曲线(如下图)  从上图我们可以很直观的看出，荧光定量PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）， 荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无 法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。由于PCR 的终产物量与起始模板量 之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增 阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 3 ．2 荧光阈值 我们一般把荧光PCR 的前15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值 和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的 一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信 号的标准偏差的10 倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设置 的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正 的信号是荧光信号超过域值（如下图）。  3 ．3 Ct 值 了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C 代表Cycle，t 代表threshold ，所谓Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。  如上图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct 值。 因为Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多， 经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。正常的CT 值范围在18-30 之间，过大和过小都将影响 实验数据的精度。 前面也提到过，同一模板经过96 次PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。根据这个特 点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct 值做出标准曲线，只要在同一次PCR 实验中得到未知 样品的Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。 3 ．4 标准曲线