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主要内容 8、切片清洗： 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间 和增多次数）尤为重要，一般在一抗的清洗是5min*3次； 注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 （2）温柔冲洗，防止切片的脱落； （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 （4）PBS的PH和离子强度的使用和要求，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。 （中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解； 低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） 9、拍照： 封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度； 正确使用荧光显微镜，防止紫外线对眼睛的损害； 检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h； 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃，一天中应避免数次点燃光源，关闭汞灯至少在开启15-30分钟后； 时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发； 使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油； 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。 免疫荧光技术常见问题 1、石蜡切片和冰冻切片的比较？ （1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 （2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫荧光时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 （3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中。由于石蜡切片可以切到4微米左右，抗体容易渗透到组织中去，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 2、一抗的选择要点和技巧是什么？ （1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗 体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面， 即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗 体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对 小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高， 但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 （2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫 沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 （3）种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存 在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 （4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根 据此来源来选择相应的二抗。 （5）生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右；而chemicon 公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不 同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。 3、在什么情况下使用Triton-X100 （1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织 化学（10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂， 在膜上打孔。 （2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂 质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推 荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。 （3）Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。 4、封闭血清的选择原则是什么？ （1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假 阳性！ （2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动