肝癌组织中HBV+RNA逆转录cDNA的初步研究.pdfVIP

第八届全国肝脏疾病临床学术大会 福州市传染病医院肝病研究所(350025)徐兵 福建省第二人民医院检验科吴林岚 福州市总医院榕桦医院杨晓梅 【摘鳓 目的 用乙肝病毒(HBV)DNA探针检测冰冻肝癌(HCC)组织中HBV cDNA 织中HBVDNA转录l青况。方法从冰冻肝癌组织中提取RNA；用SMART-PCR 为cDNA，用PCR扩增cDNA；将cDNA用Southem法转移到尼龙膜上；用地高辛标记的HBVDNA全序列反义链作为探针， A，B，C 三份肝癌组织中检测出的HBVcDNA带的数量和分子量分别是：A一条(2．5kb)，B两条(3．6kb，2．1kb)，C一条(0．5 kb kb kb)；其中2．5kb，3．6kb和2．1kb大小接近于标准的HBVRNA中2．4kb，3．5kb和2．1RNA，而0．5cDNA与标 kbHBV 准的0．8 RNA相差较大。结论肝癌组织中HBVDNA转录可能受到干扰，并不一定产生全部四种HBVRNA；产 生的cDNA有的与标准的HBVRNA分子量差别较大，可能存在与宿主细胞DNA共转录。 之一是HBV mRNA 转录隋况，有助于了解肝癌对HBVDNA的影响及宿主细胞DNA与HBVDNA共转录。检测HBVRNA的 HBV DNA全序列反义链作探针显示膜上的cDNA，与分子量Marker比较确定cDNA大小。 材料与方法 一、材料 三份肝癌组织(A，B，C)冻存标本取自法国巴黎PaulBrousse医院。取约3IrnT?癌组织(1 RNA)。QIAGENB试剂盒、QIAGEN Blood试剂盒、 rag=107细胞=100¨g PCR克隆试剂盒、QIAamp Plasmid QIAGEN Midand Mex试剂盒和QIAamp cDNA oeⅡ购自美 PrilTleDNA Detectionb、tart．erKit 国PROMEGA公司；DIGHigh Labe血ag 二、方法 QIAGENB试剂盒提取RNA。 cDNA 2．逆转录cDNA：用SMART-PCR 增cDNA。 3．合成cDNA起始单链：以mRNA或HBV 7 cDNA syntheses试剂盒中CDS 端时，逆转录酶会在已合成的cDNA单链的3 带有一段G序列，可用作另一引物，从而完成cDNA双链合成。 cDNA 4．用LD-PCR扩增已合成的cDNA：用SMART-PCR (universalprimer：舒压ART锚序列和多聚A序列)做PCR扩增。 N-aCl+0．2 将电泳后凝胶做变f生处理：把电泳凝胶浸于缓冲液(O．6mol／L mol／LNaOH)室温30min，然后 NaCl+0．5mol／LTris-