单克隆抗体的制备及应用_百替生物.pdfVIP

单克隆抗体的制备及应用 学生：周宏伟 学号：03241 导师：顾蕴洁教授 王忠教授 扬州大学农学院农学系 225009 摘要：本文着重讨论单克隆抗体的制备及其应用情况。迄今为止，单克隆抗体技术已经较 为成熟和完善，并且在很多领域开始发挥着其不可替代的作用。 关键词：单克隆抗体 制备 应用 1975年Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，使经绵羊红细胞（SRBC） 免疫的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，创立了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了 抗SRBC的单克隆抗体。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它 在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。因此说单抗技术 是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。 1单抗技术的理论依据 单抗技术的基本原理为：小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免 疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖。采用融合剂（PEG 等）将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特怔。既能在 人工培养下无限增殖，又能产生特异性抗体。 淋巴杂交瘤技术是单抗技术的重要理论依据。在前文中已经述及。Kohler和Milstein 将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由 仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin， A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞 群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只 能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞 不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲 本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。象这 种用被抗原免疫过的脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤的技术就是杂交瘤技术。 上述作为融合剂的仙台病毒在后来的实验过程中被聚乙二醇（PEG）代替。因为聚乙二 醇的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题。 然而杂交瘤技术的诞生也是免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的 克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等， 为杂交瘤技术提供了技术贮备。 2 单抗的制备的基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是适合 国内大多数实验室操作的程序。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设 备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、高压锅、精密天 平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、 真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸 service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小 瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或 塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul， ~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包 括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、 单抗的鉴定等。 2.1动物免疫 2.1.1抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需 单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研 究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来