改良茚三酮比色法测定土壤蛋白酶活性的研究.pdfVIP

维普资讯 第42卷 第2期 土 壤 学 报 Vo1．42，No．2 2005年 3月 ACTA PEDOL0GICA sINICA Mar．，2005 改良茚三酮比色法测定土壤蛋白酶活性的研究* 蔡 红 沈仁芳干 (土壤与农业可持续发展国家重点实验室 (中国科学院南京土壤研究所)，南京 210008) 摘 要 通过引入 Ca2为蛋 白酶激活剂、以Pb(cH3COO)2和 Na2C204一cH3COOH混合试剂作为除杂 剂 、将抗坏血酸与l(I 结合起来以提高茚三酮 比色法测定氨基酸 的灵敏度和稳定性 ，并使培养和测定两个 过程的pH缓冲体系有机结合起来 ，从而全面改进了土壤蛋 白酶活性 的测定方法。用该方法测定 了潮土、黄 棕壤和红壤的蛋白酶活性 ，并与常用的Folin比色法进行 了试验 比较 ，证 明该方法适合于测定中性、碱性土壤 的蛋 白酶活性并优于 Folin比色法。 关键词 土壤蛋白酶；茚三酮 ；比色 中图分类号 S154．2 文献标识码 A 蛋白酶能够分解蛋白质、肽类为氨基酸 ，参与调 一 套 自己的试验方法 ，结果证 明该方法测定土壤蛋 节生物的氮素代谢。在土壤 中，蛋白酶 由于微生物 白酶活性效果 良好。 活动、植物根系分泌和动植物残体的分解而富集起 来 ，成为土壤中的一种重要胞外酶 ，该酶具有离体活 1 试验原理 性 ，能够参与土壤的氮素循环。重金属、有机污染物 和不 良土壤 pH都可 以抑制土壤蛋 白酶的活性，因 在蛋白酶的作用下 ，蛋白质水解可得到一系列 此 ，蛋 白酶活性可以反映土壤的环境质量状况。 中间产物 ，最终生成 a．氨基酸_7J： 1972年 ，Ladd和 Butler提出了用酪素为底物，以 蛋 白质一蛋 白朊一蛋 白胨一多肽一二肽一a．氨 pH8．1的 s—HCl缓冲液培养土壤，以三氯乙酸为 基酸 蛋白质沉淀剂，并采用 Lowry等改进的Folin比色法 将蛋白质加入含有蛋 白酶的溶液里分解一段时间， 测定土壤蛋 白酶活性 的方法_1l2J，此后不断有学者 再测定生成的a．氨基酸的含量，可 以反映蛋 白酶的 加以引用 ，并有不同程度的修改 ，例如 ，Dilly和Jean 活性 。 将培养 时间延长为 2h_3；Marcote等 以及 Dilly和 测定氨基酸含量最常用的办法之一是茚三酮比 Nannipieri在其他条件基本不变的情况下将对照改 色法 ，主要分为两个步骤 ：(1)在微酸性环境下茚三 为培养后加入底物 ，但缓冲液 的pH、沉淀剂种类和 酮与氨基酸发生氧化还原反应 ，氨基酸被氧化为氨、 比色试剂等关键环节没有太大变化_4．5；而Watanabe 二氧化碳和醛 ，茚三酮则被还原 ；(2)还原型茚三 和 Hayano则改变底物 为 benzyloxycarbony1．L．1eucine， 酮 、氨和另一分子茚三酮进一步反应生成二酮茚一 将培养温度降低为30~C，培养时间延长为 5h，测定 二酮茚胺的取代盐，呈蓝紫色，其最大吸光波长为 方法改为茚三酮比色法_6J，改变幅度较大 ，但 由于采 570nm，颜色深度与氨基酸的含量呈正相关_8J。 用了茚三酮显色试剂而没有改变测定的缓冲条件 ， 由于蛋 白质分子本身含有氨基，也能够参与显 我们在运用此方法时发现其测定结果可比性、重现 色反应 ，因此必须首先除去蛋白质。可以通过加入 性较差。 适当的沉淀剂达到这一 目的。另外 ，反应液 的pH、 为了更准确地测定土壤蛋白酶活性 ，我们在整 杂质离子、反应时间及温度