应用PCR技术快速检测柑桔溃疡病的研究.pdfVIP

中国南方果树2005；34(2)：1～4 应用PCR技术快速检测柑桔溃疡病的研究* 唐科志 周常勇 王雪峰 周 彦 刘科宏 刘 英 (中国农业科学院柑桔研究所 重庆400712) 提 要 应用PCR检测柑桔溃疡病，所用引物为5’TTGGTG 3’和 5cAcGGGTGcAAAAAATCT 3’。从病样的叶片、果皮和枝皮抽提溃疡病菌核酸进行PCR扩增， 其产物经琼脂糖凝胶电泳，产生大约220 bp的特征条带，与纯培养溃疡病菌的PCR产物一致。试 验比较两种核酸抽提方法，微量快速抽提法的灵敏度明显高于高盐抽提法。有症状病样品的不同 部位均能检测到溃疡病；病株的无症状叶片、果皮、枝皮有部分检测到病菌。病果园健康植株大多 数检测不到病菌，少数植株PCR产物电泳条带较弱。取样量以10～20mg为宜。该PCR技术可 用于快速检测柑桔溃疡病。 关键词柑桔溃疡病；PCR；快速检测 由柑桔溃疡病菌[Xanthomonascampestris 重要的国际国内检疫性病害，严重影响柑桔安全生产和对外贸易。该病主要通过苗木、接穗 和果实远距离传播，有时带菌土壤亦能传病。病菌在病部长期存活，借风雨、昆虫和枝叶交接 在田问扩散，引起病树叶片脱落、枝梢枯死和早期落果。成熟果实病斑累累，品质及商品等级 下降。在我国多数甜橙和柚类产区此病有不同程度发生。在新发病的地区，需要采用挖除病 树集中烧毁的根除方法。为了疫情的早发现、早处理，有必要建立一种稳定、可靠、快速的检 抽提方法、不同取样量和不同取样部位的检测结果进行了比较。此外，应用这种方法检测其 他病害的病斑，以期确认这种方法适用于鉴别可疑病斑。现将研究结果报告如下。 1材料与方法 1．1柑桔溃疡病菌DNA的提取 。 采用同一批柑桔溃疡病叶片病斑样品，分别应用高盐法和微量快速法抽提溃疡病菌 康植株叶片作为阴性对照样品，柑桔溃疡病菌菌液作为阳性对照样品。 1．1．1高盐法 参照Aljanabi等[11的方法。取100mg柑桔组织在研钵中用液氮磨成粉末 转入1．5ml离心管内，再加入400 mg／ml的蛋白酶K8“1， tA抽提缓冲液混匀；加入20 M NaCl 000 65℃中水浴2小时以上或过夜；加入6 300”l，涡旋混匀后离心(13rpm，30分 钟)；取上清液并加入无水乙醇1 醇，用70％乙醇洗沉淀；风干沉淀10分钟；用1001倍TE缓冲液4℃下悬浮保存。 ul 1．1．2微量快速法 参照周常勇等口]的方法稍加改动。取叶片、果皮、枝皮10～20mg加入 1．5ml离心管，在液氮中研磨；加入适量抽提缓冲液(TNE 200 250弘l，phenol 50 *国家科技攻关“三峡库区特色产业生态经济重建关键技术研究与示范”项目资助。 万方数据万方数据 2 中国南方果树 第34卷 100扯l悬浮，4℃或一20C保存备用。 1．2 PCR扩增与电泳 PCR扩增参照澳大利亚Deborah GTG TCT TCGTCGCTTGTAT GGGTGCAAAAAA