蛋白质高分辨结构测定与高效制备技术2009CB918600-G.docVIP

项目名称： 蛋白质高分辨结构测定与高效制备技术 刘买利 中国科学院武汉物理与数学研究所 2009.1至2013.8 中国科学院 目前蛋白质结构研究存在的问题是难以高效制备适合结构测定的蛋白质样品、蛋白质晶体结构测定中对样品质量要求过高和自动化程度低、核磁共振技术测定蛋白质结构周期长且受到分子量上限的制约。针对这些问题，本项目拟整合国内核磁共振波谱学、基于同步辐射的X-射线晶体学和蛋白质制备等领域的优势力量，发展具有自主知识产权的高分辨率、高灵敏度和快速蛋白质三维结构测定的新技术和新方法，及与之相匹配的蛋白质高效制备技术，并通过与关键生物学问题密切相关的蛋白质及蛋白质复合体结构和功能研究来检验和优化本项目所发展的各种新技术和新方法。 拟解决的关键科学问题： 1、针对目前难以高效制备适合结构测定的蛋白质这一瓶颈问题，综合运用可溶性表达、包涵体变复性和无细胞翻译等多种技术，并借助NMR动态监测与折叠优化技术，获得正确折叠的活性蛋白用于结构测定。 2针对蛋白质晶体结构测定中对样品质量要求过高和自动化程度低等问题，发展长波长反常散射技术和相位解析新技术以降低对晶体质量的要求；通过数据采集和处理的同步化提高结构测定的自动化程度；综合运用基于同步辐射的小角散射、X-射线晶体学和NMR等技术，测定蛋白质及复合体结构。 3为突破NMR测定蛋白结构的分子量上限，并提高其测定速率，本项目拟发展同位素标记技术和快速NMR技术，发展动态NMR技术检测弱相互作用，发展固体魔角旋转NMR技术用于膜蛋白结构测定。 针对以上问题，本课题主要研究内容如下： 提高蛋白质样品制备的效率 1、发展基于HSQC的快速鉴定蛋白质折叠和聚集的方法，用于蛋白质及复合体制备过程的监控，使之适合结构测定。 2、开发一系列便于操作的双融合表达载体，发展高效蛋白质可溶性制备与纯化新技术，实现目标蛋白快速表达与纯化。 3、在已有包涵体双变性复性专利技术的基础上，筛选新的包涵体变性和复性工艺，提高专利技术的通用性，以解决包涵体变复性这一瓶颈问题。 4、利用绿色荧光蛋白(GFP)以及FSEC技术，实现膜蛋白可溶性表达和检测。并建立麦胚和盘基网柄菌等无细胞膜蛋白表达体系。 5、通过多顺反子共表达策略构建载体，实现蛋白复合体共表达。 二发展蛋白质结构测定新技术，降低对样品的需求，提高结构解析的效率 1、对于结晶样品，发展基于同步辐射的蛋白质和复合体三维结构测定新技术 （1）发展自动操作技术，实现实验条件优化和数据采集、传输、处理的同步化，提高结构测定的自动化程度。 （2）利用小角散射得到的溶液状态下复合体外形，结合各组分结构，并借助分子动力学优化和NMR技术测定相互作用界面，获得复合体结构。 （3）以小角散射得到的蛋白质低分辨形状为初始模型，结合密度修正等方法解决X-射线晶体学中的相位问题。 （4）利用本项目发展的自动化技术，快速确定长波长反常散射实验的最佳波长和数据采集策略，实现全新结构的解析。 2、对于可溶蛋白质样品，发展核磁共振测定的新技术和方法，解析蛋白质和复合体结构 （1）发展基于偶极相互作用和极化转移机制的高灵敏度蛋白质NMR方法；利用选择性13C、15N和2H标记技术，提高NMR结构测定的蛋白质分子量上限。 （2）发展新的脉冲序列和相位循环方法，减少PR-NMR谱中的误差和伪峰；完善和优化PR-NMR重建算法，消除强对角峰引起的噪音信号，提高重建图谱质量。 （3）发展基于CPMG、极化转移和化学交换等NMR实验方法，并结合变场强实验，用于蛋白相互作用的研究和中间过程的捕获。 （4）发展测定膜蛋白主链扭转角（Ψ、Φ）和原子核间距的新方法；借助液体NMR脉冲模块，建立适合研究不同运动特征的膜蛋白链段的极化转移方法，用于膜蛋白结构测定。 三将以上技术应用一些生物学问题 1、与疾病相关的蛋白质及其复合体结构研究：与HIV病毒感染相关的Vta1及复合体Vta1NTD/Vps60，前列腺癌相关蛋白复合体LSD1/JMJD2C/AR，与红斑狼疮有关的OSCP蛋白及复合体。 2、与膜相关的重要蛋白质及复合体结构研究：革兰氏阴性菌外膜蛋白运输核心-Yaet复合体，对细胞极性的产生及维持起关键作用的PAR-3/PAR-6/aPKC大型复合体。 3、与核酸相互作用的重要蛋白质及其复合体：对神经元基因表达起负调控作用的NRSF/REST蛋白复合体等。 发展具有自主知识产权的X-射线晶体学、核磁共振波谱学结构测定新技术、新方法及与之配套的蛋白质高效制备技术体系，使我国在相关领域的研究达到国际先进水平，为我国科学家在蛋白质科学前沿领域的研究提供重要的技术支撑。 1、建立适合于结构测定的蛋白质高效制备技术体系，包括：研制5个以上含不同标签的双融合表达载体，实现目标蛋白的高效表达与纯化；开