miR-138对小鼠乳腺上皮细胞的作用及其调控的靶序列.pdfVIP

维普资讯 Plfll! www．pibb．ac．cn miR．138对小鼠乳腺上皮细胞的作用 及其调控的靶序列 串 王春梅 李庆章 “李 晔 (东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030) 摘要 miRNA是一类长约20~25nt的内源性非编码蛋 白的小RNA．miRNAs的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化 和死亡等过程，但 目前对miRNA在细胞中的确切功能和其如何发挥作用知之甚少．应用miRNA基因沉默技术，抑制小鼠 乳腺上皮细胞miR-138的表达，应用荧光定量PCR、Westernblot、细胞活力分析技术等分析mi．138的表达及miR．138对小 鼠乳腺上皮细胞的影响，结果显示，miR．138抑制后细胞活性增强(P0．05)，PRL．R蛋 白表达增强 (P0．05)，信号转导通路 分子 STAT5、MAPK表达加强．研究认为，miR．138抑制小鼠乳腺上皮细胞的增殖．miR．138在乳腺上皮细胞调控的靶序列 是PRL-R，抑制其表达而发挥作用．miR．138通过调控 STAT5、MAPK信号转导通路而调控乳腺上皮细胞增殖． 关键词 乳腺上皮细胞，miR．138，基因沉默 学科分类号 Q78，$73 microRNA(miRNA，即微小RNA)是长度约为 要的调控作用[5．6】．但 目前miRNA在乳腺发育、泌 20~25nt的5端带磷酸基 团和 3端带羟基的非蛋 乳及退化中的作用及其机制尚未见报道． 白编码的小RNA家族ix]．miRNA可以通过部分互 为更好地研究miR．138在乳腺发育、泌乳及退 补结合到 目的n~RNA靶位的3非编码区r3UTRs)， 化 中的作用及其机制，应用miR．138沉默技术抑制 以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋 内源性miR．138，以探讨miR．138功能及作用机制． 白质合成 ．哺乳动物乳腺的发育过程与其他器官不 1 材料与方法 同，主要是在雌性动物性成熟后的妊娠期迅速完 成 ．乳腺发育、泌乳及退化过程受到激素等诸多因 1．1 材料 素 的调 控 ，催 乳 素 (prolactin，PRL)及 其 受 体 小 鼠乳腺上皮细胞 由本研究室培养、分离、纯 (prolactin．receptor，PRL．R)对乳腺生长和分化有广 化和鉴定 NegativeControl、miR．138inhibitor、 泛的作用[2】．STAT5在调控细胞增殖、分化及凋亡 miR．138、内参 5sRT及荧光定量 PCR引物 由美 过程 中起重要作用，STAT5在正常乳腺组织中有 国Ambion公司合成 ．小RNA分离试剂、荧光定 一 个基础的活化水平 以传递上游来的信号．PRL．R 量 PCR 试 剂 盒 、 siPORTNeoFX 均 购 自美 国 激活的信号转导激活转录子 STAT5的活动[3】，同 Ambion公司．DMEM、Opti．MEM Imediam、胎 时在乳腺上皮细胞中，PRL．R还可激活丝裂原活化 牛血清购 自Gibco公司．角蛋白18FITC直标抗体 蛋 白激酶(MMAPK)信号转导通路，MMAPK通过 购 自德 国Acris公司，PRL．R、STAT5、MAPK、 影响基因的转录和调控 ，进而影响乳腺上皮细胞 B—actin多克隆抗体购 自Santa公司，辣根过氧化物 的生物学行为，如细胞增殖、分化、转化及凋亡 酶标记抗体购 自北京中山生物技术公司，ECL发 等4[]． miRNAs在乳腺发育、泌乳及和退化过程中发 黑龙江省博士专项基金资助(2005)． 通讯联系人． 挥重要的作用，其中miR-138在乳腺发育周期中呈