半胱氨酸对猪卵母细胞体外发育潜力的影响.pdfVIP

半胱氨酸对猪卵母细胞体外发育潜力的影响 王晓明，洪淳锡，崔成哲，具龙哲，孙成春，白红女，秦炜赜 (延边农业科学研究院 畜牧研究所，133400) 摘要 ：本研究的 目的是探讨在卵母细胞体外成熟过程中向培养液中添加不同浓度的半胱 氨酸对猪卵母细胞体外成熟和体外受精 的影响．实验结果表明：半胱氨酸在浓度为 0．Img／ml时．卵母细胞体外成熟率和受精率都显著提高 (pO．05)，同时测定了不同浓度的 半胱氨酸培养的卵母细胞在24h、36h、46h细胞内GSH含量，其浓度在卵母细胞成熟过程中 随 成 熟 时 问逐 渐 升 高 ，当 卵母 细 胞 进 入 MII期 时 ，GSH 浓 度 达 到 高 峰 (7．36—8．57pmol／oocyte)．GSH的浓度反映了卵母细胞细胞质的成熟度，可以作为卵母细胞 细胞质成熟度的一个特征性指标． 关键词：半胱氨酸：谷胱甘肽 (GSH)：卵母细胞． 体外受精技术也称胚胎生产技术 (invitroproduction，IVP)，包括卵母细胞 的体外成熟，精子的获能和卵子的体外受精和受精卵的体外培养等几个连续的步骤。 卵母细胞是胚胎工程中最为重要的一种实验材料，体外培养过程中卵母细胞的成熟 质量是影响胚胎体外生产的重要因素。 半胱氨酸在MI期向MII期发育阶段对前核的形成起着关键的作用…，Yoshida( 1993)用富含半胱氨酸的培养液培养猪的卵母细胞，提高了体外受精后的雄原核形成 率堙。半胱氨酸是GSH的前体物质，在牛的IVM中疏基复合物能增加细胞内的GSH的合 成。在受精和胚胎的开始阶段保持高浓度GSH可以增加发育率。 本实验在成熟培养液中添加半胱氨酸，观察不同浓度的半胱氨酸培养的卵母细 胞的成熟率、受精率及不同时间细胞内GSH的浓度情况，探讨半胱氨酸和GSH在卵母 细胞发育过程中的作用。 l 实验材料 1．1猪卵巢的采集与运输 猪卵巢采集于龙井市屠宰场。刚摘取的卵巢立即置入添加双抗的37~C灭菌生理 盐水中，1．5h内送回实验室。 1．2成熟培养液的配制 成熟培养液：TCMI99+IO~ 卵泡液 (PFF)+激素+半胱氨酸酸+双抗 (65mg／L青霉 素，50mg／L链霉素)。实验中所用的试剂若无特殊说明，则均来 自sigma公司；激素 购 自宁波激素制品厂；猪卵泡液 (PFF)采用常规血清方法 自制。受精液采用改 良Tris 缓冲液 (mTBM)，洗精子液则采用Dubecco’s磷酸缓冲液 (DPBS)。 5O 2实验方法 2．1猪卵巢及卵丘一卵母细胞复合体 (COOs)的收集 卵巢组织用灭菌的生理盐水清洗3次，除尽周围的脂肪和系膜，灭菌的医用纱布 吸干，用18号针头的无菌注射器抽取卵巢表面直径为2．-~6mm的卵泡，放入5ml的离 心管中37℃水浴沉淀10分钟后，实体显微镜下捡卵。选择卵丘颗粒细胞在3层或3层 以上、包裹致密、卵母细胞胞质黑色均一的C0Cs用于成熟培养 (图la)。 2．2卵母细胞的选择 选择具有完整的卵丘细胞层及均匀细胞质的卵母细胞 (图la)，用TCMI99 +IO％PFF清洗三次，移入已预培养24-,时以上35m培养皿的液滴中。每个培养小滴放 入10枚卵母细胞。培养条件为95％空气、5％c02、38C及饱和湿度，培养44—484,时 (图 1b)。 2．3卵母细胞成熟的判定 体外培养 44h的卵母细胞 (图 Ib)，经含 0．25％胰蛋白酶的PBS消化除去卵丘 细胞，1OIXg／mlHoechst33342染色，荧光显微镜观察细胞核和极体 (图2)，细胞 核成熟的标准为排出极体 (图lc)。 2．4絮外分光光度计测卵母细胞内GSH的含量 实验用UV3010紫外分光光度计测定细胞 内的GSH的含量，按照BiancaGasparrini 等人的方法测定 。 2．5实验设计 ． [实验一]：不同浓度的半胱氨酸对猪卵母细胞体外成熟的研究 猪初级卵母细胞分别在添加浓度为0，0．05，0．I，0．2mg／ml半胱氨酸改良的 mTCM-199的培养液中484时后，胰蛋 白酶的消化液中消化并用旋涡震荡仪震荡 2．5min去掉周围的颗粒细胞，用H33342染色lOmin后，在荧光显微镜观察极体和细胞 核，数码相机 (SONY