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中国农业科学 2009,42(3):960-966 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.026 中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析 张建文，王跃进，朱自果，王沛雅，张朝红 （西北农林科技大学园艺学院/农业部西北园艺植物种质资源及遗传改良重点开放实验室/ 陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中 国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata ）白河-35-1 株系为材料，以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理，以 田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照，分别提取 RNA，采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和 反交两个文库，在文库中，选择 3 个 EST 序列，用半定量 PT-PCR 检验构建文库中 EST 片段的表达情况。【结果】 构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp，经筛选文库，得到正交库有效的ESTs 85条，反交库ESTs 29条, 所获序列经过 BLASTn 和 BLASTx 网上序列比对，其中有 78 条 ESTs 与 GenBank 中其它植物相关基因序列有较高的 同源性，31条为未知功能序列，已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析，证明这些EST 序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能， 涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面，其中获得与抗病直接 相关的 ESTs 23 条，下一步是通过对获得的 EST 序列进行末端快速分析（RACE）技术，获得抗霜霉病基因全长序 列，并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能，为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。 关键词：中国野生葡萄；抑制消减杂交；霜霉病；EST序列 Construction and Preliminary Analysis of the SSH Library of Chinese Wild Vitis pseudoretioulata Resistance to Downy Mildew ZHANG Jian-wen, WANG Yue-jin, ZHU Zi-guo, WANG Pei-ya, ZHANG Chao-hong (Key Laboratory of Horticultural Plant Germplasm Resources and Genetic Improvement in Northwest China of Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China/Key Laboratory for Molecular Biology of Agriculture of Shaanxi Province of the People’s Republic of China/College of Horticulture, Northwest Science and Technology University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, Shaanxi) Abstract: 【Objective 】 Isolating disease-resistance ESTs against downy mildew from Chinese wild Vitis pseudoretioulata Baihe-35-1. 【Method 】 To obtain a differentially expressed genes library, a forward-suppression subtractive hybridization library and